化技术中固定化酶容易泄露的缺陷，提高了操作稳定性，共固定化酶使用八个周期 时仍保持70%以上的转化率。
[0037] 将本发明应用到L-半胱氨酸的工业化生产中，可极大的提高生产效率与生产成 本，其具有重要的工业应用价值。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0039] 实施例1DL-ATC消旋酶/L-ATC水解酶融合蛋白的制备
[0040] 1、材料
[0041 ] 菌种：大肠杆菌BL21 (DE3)，购自Promega公司。
[0042] 质粒：质粒pET28a(+)购自武汉淼灵生物科技有限公司。
[0043] LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。
[0044] 卡那霉素抗性平板：含有30mg/L卡那霉素、I. 5 %琼脂粉的LB固体培养基。
[0045] 卡那霉素抗性LB培养基：含有30mg/L卡那霉素的LB液体培养基。
[0046] 2、方法
[0047] (I) atcAB表达载体的构建
[0048] 将来源于假单胞菌Pseudomonas sp. BS株基因组的DL-ATC消旋酶基因（atcA) (GenBanK登录号为：BAD15357)与L-ATC水解酶基因（atcB)(其序列信息存在于一段 GenBanK登录号为AB176845的一段大小为IOKb的DNA序列内）进行密码子优化，在优化 后的两基因序列中间添加一段编码刚性连接肽的序列，形成atcA/atcB的融合表达框，该 融合表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，该段融合表达框编码的蛋白质则命名为 AtcAB，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。在该表达框的5'端及3'端分别引入酶切位点 NdeI及EcoRI后化学合成如SEQ ID NO. 3所示的全基因序列，将此序列命名为opt-atcAB。 opt-atcAB全基因序列的合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成，交货时人工合成的基因 片段opt-atcAB连于载体pUC57上。将含有opt-atcAB片段的载体pUC57用NdeI及EcoRI 进行双酶切后回收目的片段，备用。同时采用NdeI及EcoRI对表达载体pET28a(+)进行双 酶切，并将经双酶切后获得的opt-atcAB基因连入pET28a(+)载体中，转化大肠杆菌T0P10， 构建表达载体pET-atcAB。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误后提取质粒备用。
[0049] (2)BL21(DE3)感受态细胞的制备
[0050] 1)挑取LB平板上的大肠杆菌菌株BL21 (DE3)，培养过夜。
[0051] 2)将培养过夜的菌液按照1% (V/V)的接种量转入装有50mL LB液体培养基的 300mL的三角瓶中培养，OD6。。至0. 4左右时停止培养，置冰上20min，4°C、4000g离心10min。 弃上清，加入冰冷的IOOmM的〇&(：12溶液悬浮，冰上静置30min。离心浓缩，获得BL21 (DE3) 感受态细胞，放于_70°C保存。
[0052] (3) pET-atcAB表达载体的转化
[0053] 1)将50ng的表达载体pET-atcAB转入100 μ L步骤⑵所制备的BL21 (DE3)感受 态细胞中，混匀，置冰上30min，42°C热激90s，冰上静置2min。
[0054] 2)加入900 μ L的LB液体培养基，37 °C、100转/min培养Ih。
[0055] 3)涂布卡那霉素抗性平板，培养过夜，挑取单菌落培养后提取质粒进行酶切验证， 获得工程菌株BL21 (DE3) +atcAB，该菌株可诱导表达重组融合蛋白AtcAB。
[0056] (4)重组蛋白的表达与纯化
[0057] 挑取工程菌株BL (DE3) +atcAB的单个菌落并接种入IOOmL卡那霉素抗性LB培养 基中，于37°C培养过夜。取出菌液后，按1:100(V/V)接种于IOOmL卡那霉素抗性LB培养 基中，于37°C培养至0D6。。= 0. 6时，加入lmol/L IPTG至终浓度为lmmol/L，于37°C摇菌 培养，诱导融合蛋白AtcAB表达。诱导4h后于8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌 体用 20mL 磷酸盐缓冲液（8g/L NaCL，0. 2g/L KCl，0· 24g/L KH2PO4,1. 44g/L Na2HPO4, pH = 7. 4)洗涤3次并用IOmL上样缓冲液（20mM Na3PO4,0. 5M NaCl ; IOmM咪挫，pH7. 4)重悬后 进行超声破碎，操作条件为：50HZ，200W，超声3S，间歇5S，工作100次。超声完成后，12000g 离心15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测。发现重组融合蛋白AtcAB以可溶性表达 方式存在于菌体中，激光薄层扫描分析显示，目标蛋白占菌体总蛋白的25%左右。
[0058] 将上述获得的超声破碎上清液用0. 45 μπι的滤膜进行过滤后用His Trap affinity columns (GE healthcare公司产品），按照说明书的方法进行重组融合蛋白的纯 化。具体方法如下：
[0059] 1)用5mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器连接上， 以lmL/min流速洗柱。
[0060] 2)用IOmL上样缓冲液平衡，lmL/min流速。
[0061] 3)将融合蛋白（过滤后的超声破碎上清液）上样，lmL/min流速。
[0062] 4)用IOmL上样缓冲液，以lmL/min流速洗柱。
[0063] 5)用 20mL 洗涤缓冲液（20mM Na3P04,0. 5M NaCl，40mM 咪唑，ρΗ7· 4)，以 lmL/min 流速洗柱。
[0064] 6)用 IOmL 洗脱缓冲液（20mM Na3PO4,0· 5M NaCl，300mM 咪唑，ρΗ7· 4)，以 lmL/min 流速洗脱，分管收集，每管lmL，12% SDS-PAGE检测，合并洗脱组分中含有目的蛋白的样品， 冻干保存备用。重组蛋白经此镍柱亲和层析纯化后，SDS-PAGE显示其纯度在90%以上。
[0065] 实施例2重组氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的制备
[0066] 1、材料
[0067] 菌种：大肠杆菌BL21 (DE3)，购自Promega公司。
[0068] 质粒：质粒pET28a (+)购自武汉淼灵生物科技有限公司。
[0069] LB液体培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。
[0070] 卡那霉素抗性平板：含有30mg/L卡那霉素、I. 5 %琼脂粉的LB固体培养基。
[0071] 卡那霉素抗性LB培养基：含有30mg/L卡那霉素的LB液体培养基。
[0072] 2、方法
[0073] (I) atcC表达载体的构建；
[0074] 将来源于假单胞菌Pseudomonas sp. BS株基因组的氮一氨甲酰_L_半胱氨酸水解 酶基因（atcC)(其序列信息存在于一段GenBanK登录号为AB176845的一段大小为IOKb的 DNA序列内）进行密码子优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO. 5所示，该段基因序列编码 的蛋白质则命名为AtcC，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。在优化后的基因的5'端及3' 端分别引入酶切位点NdeI及EcoRI后化学合成如SEQ ID NO. 6所示的全基因序列，将此序 列命名为opt-atcC。opt-atcC全基因序列的合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成，交货 时人工合成的基因片段opt-atcC连于载体pUC57上。将含有opt-atcC片段的载体pUC57 用NdeI及EcoRI进行双酶切后回收目的片段，备用。同时采用NdeI及EcoRI对表达载体 pET28a(+)进行双酶切，将经双酶切后获得的opt-atcC基因连入pET28a(+)载体中，并转化 大肠杆菌T0P10,构建表达载体pET-atcC。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误后提 取质粒备用。
[0075] (2)感受态细胞的制备
[0076] 1)挑取LB平板中的大肠杆菌菌株BL21 (DE3)，培养过夜。
[0077] 2)将培养过夜的菌液按照1% (V/V)的接种量转入装有50mL LB液体培养基的 300mL的三角瓶中培养，OD6。。至0. 4左右时停止培养，置冰上20min，4°C、4000g离心10min。 弃上清，加入冰冷的IOOmM的〇&(：12溶液悬浮，冰上静置30min。离心浓缩，获得BL21 (DE3) 感受态细胞，放于_70°C保存。
[0078] (3) pET-atcC表达载体的转化
[0079] 1)将50ng的表达载体pET-atcC转入100 μ L步骤⑵所制备的BL21 (DE3)感受 态细胞中，混匀，置冰上30min，42°C热激90s，冰上静置2min。
[0080] 2)加入900 μ L的LB液体培养基，37 °C、100转/min培养Ih。
[0081] 3)涂布卡那霉素抗性平板，培养过夜，挑取单菌落培养后提取质粒进行酶切验证， 获得工程菌株BL21 (DE3) +atcC，该菌株可诱导表达重组蛋白AtcC。
[0082] (4)重组蛋白的表达与纯化
[0083] 挑取工程菌株BL (DE3) +atcC的单个菌落并接种入IOOmL卡那霉素抗性LB培养基 中，于37°C培养过夜。取出菌液后，按1:100 (V/V)接种于IOOmL卡那霉素抗性LB培养基中， 于37°C培养至0D6。。= 0. 6时，加入lmol/L IPTG至终浓度为lmmol/L，于37°C摇菌培养，诱 导重组蛋白表达。诱导4h后于8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌体用20mL磷酸 盐缓冲液（8g/L NaCL，0. 2g/L KC1，0. 24g/L KH2PO4,1. 44g/L Na2HPO4, pH = 7. 4)洗