HPV-16 E7nl94病毒为例，纵坐标表示杀伤率） 所示。被本发明rAAV感染的DC所诱导的CTL能够更有效地裂解（杀伤）HPV-16 E7抗原 阳性的靶细胞，对各种HPV-16 E7抗原阳性的肿瘤细胞的杀伤率为40% -67%左右，而对 HPV-16 E7阴性的肺（lung)、乳腺（breast)、肝（liver)、肾（k-cells)的细胞为对照，无杀 伤作用，证明被本发明rAAV感染的DC所诱导的CTL具有抗原特异性（即靶向性），而对抗 原阴性的细胞无杀伤作用。
[0129] 上述检测结果表明，被本发明携带突变型HPV-16 ETni94抗原基因的重组腺相关病 毒（AAV/HPV-16 E7"94病毒）感染的DC所诱导的CTL对HPV-16 E7抗原阳性的细胞具有强 大的杀伤（裂解）效果，具有较高的特异性（即靶向性杀伤作用），而对HPV-16 E7抗原阴 性的细胞无杀伤作用，与野生型HPV-16 E7抗原诱导的CTL的杀伤功能无区别，而且无致瘤 性，可用于制备抗肿瘤药物。
[0130] 实施例5、HPV-16 E7抗原阳性的肿瘤治疗的临床实验
[0131] 应用重组腺相关病毒-树突状细胞技术，即实施例4中被本发明AAV/HPV-16 E7"94病毒感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL)回输治疗5例宫颈癌患者。所有患者 已经被证实其宫颈癌组织为HPV-16 E7阳性。输注量为2 X 10s-5 X 108。治疗疗程：通常为 3个月为一个疗程，每月2次。治疗结果总结如表1所示（B:血清肿瘤标志物减少或消失。 Q:病人生活质量改善。如疼痛减轻或消失，食欲增加等。C:CT or PET-CT显示癌症病灶或 转移病灶明显减小或消失。），不良反应：1例治疗后短时间内会出现轻度流感样反应，但病 人均能承受，且症状短期内消失，没有观察到严重不良反应及毒性反应。
[0132] 5例经重组腺相关病毒AAV/HPV-16 Ε7"94病毒感染的DC所诱导的CTL治疗的宫颈 癌患者血清角质蛋白19抗原（CK19)和鳞状细胞癌抗原（SCC)水平的变化情况如图12所 示，经治疗后，3例患者的血清角蛋白19抗原（CK19, cyfra21-l)和鳞状细胞癌抗原（SSC) 明显下降（CK19水平，正常值〈3. 3ng/mL ;SCC水平，正常值〈5. Ong/mL)，甚至恢复正常。临 床实验结果证明，被本发明rAAV感染的DC所诱导的CTL在患者体内能够发挥一定的疗效， 可有效地抑制HPV-16 E7阳性的恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞，且安全性较高，可 用于制备抗肿瘤药物。
[0133] 表1用AAV/HPV-16 ETni94-树突状细胞技术治疗5例宫颈癌癌患者的疗效的统计 结果
[0135] 工业应用件
[0136] 实验证明，被本发明HPV-16 ETni94重组腺相关病毒感染的树突状细胞和所诱导的 细胞毒性T淋巴细胞在患者体内可有效地抑制HPV16感染的细胞以及与其相关的恶性肿瘤 细胞的生长或者杀灭恶性肿瘤细胞，因而，本发明的HPV-16 ETni94重组腺相关病毒载体或与 本发明HPV-16 Ε7"94重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于制备抗HPV16感染的细胞及 其相关的抗恶性肿瘤药物，在临床治疗和应用中具有重要的意义。
【主权项】
1. 一种携带人乳头瘤病毒16型突变型E7 "94抗原基因的重组腺相关病毒载体，是将目 的基因突变型HPV-16ETni94抗原基因或野生型HPV-16E7抗原基因插入腺相关病毒载体中， 获得携带HPV-16ETni94抗原基因的重组腺相关病毒载体（简称"E7"94重组腺相关病毒载体" 或AAV/HPV-16ETni94)或携带HPV-16E7抗原基因的重组腺相关病毒载体（简称"E7重组 腺相关病毒载体"或AAV/HPV-16E7)。2. 根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：所述突变型HPV-16E7 "94 抗原基因是将HPV-16E7抗原基因的E7抗原蛋白第94位的半胱氨酸（G)改变为甘氨酸 (C)对应的基因，即，将HPV-16E7基因开放读码框（nt280)的胸腺嘧啶⑴替换为鸟嘌呤 (G)，将编码半胱氨酸的tgt(nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt，获得可以表达无致瘤性 的突变型HPV-16E7"94基因。3. 根据权利要求1或2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：所述HPV-16E7 "94基 因的核苷酸序列如序列表中序列1或图3所示。4. 根据权利要求1-3任一所述的重组腺相关病毒（rAAV)载体，其特征在于：所述腺相 关病毒载体为剔除腺相关病毒（AAV)结构基因Rep和Cap的腺相关病毒载体，其携带的启 动子为AAVp5启动子、巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV)启动子、人beta肌动蛋白启 动子或SV40病毒早期启动子中的任意一个，所述携带HPV-16 ￡7"94抗原基因的重组腺相关 病毒载体统称为17"94重组腺相关病毒载体"或AAV/HPV-16E7 "94。5. -种构建权利要求1-4任一所述重组腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤： 1) 将HPV-16E7抗原蛋白的第94位半胱氨酸突变为甘氨酸，即将HPV-16E7基因开放 读码框（nt280)的胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌呤（G)，即将编码半胱氨酸的tgt改变为编码甘 氨酸的ggt，获得无致瘤性的突变型HPV-16ETni94基因； 2)将HPV-16 ETni94抗原基因或野生型HPV-16 E7抗原基因插入所述ETni94重组腺相关病 毒载体中，得到携带HPV-16 ETni94抗原基因的重组腺相关病毒载体（统称AAV/HPV-16 ETni94) 或携带HPV-16 E7抗原基因的重组腺相关病毒载体（统称AAV/HPV-16E7)。6. 与权利要求1-4任一所述重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16ETni94和重组腺相关病毒 载体AAV/HPV-16E7相关的产品，包括重组腺相关病毒质粒、重组腺相关病毒颗粒和被所述 重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系，细胞系包括单核细胞（Monocyte，Mo)和树突状 细胞（DendriticCells，DC) 〇7. 制备权利要求6所述与重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E7和AAV/HPV-16E7 "94相 关产品的方法，分别为： 携带HPV-16E7或HPV-16 ￡7"94抗原基因的重组腺相关病毒载体质粒的制备：将携带HPV-16E7或HPV-16ETni94抗原基因的重组腺相关病毒载体DNA-AAV/HPV-16E7或AAV/ HPV-16 ￡7"94导入基因工程大肠杆菌（E.coli)DH5a感受态细胞，用含lOOyg/mL氨苄青霉 素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到AAV/HPV-16E7质粒或 AAV/HPV-16ETni94质粒； 携带HPV-16E7或HPV-16ETni94抗原基因的重组腺相关病毒的制备：以所述携带HPV-16E7或HPV-16ETni94抗原基因的重组腺相关病毒载体质粒和pHelper质粒共同转染 AAV-HEK293细胞得到rAAV病毒，分别命名为AAV/HPV-16E7病毒或AAVZHPV-IeETni94病毒； 携带HPV-16E7或HPV-16ETni94抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系 的制备：用所述重组腺相关病毒AAV/HPV-16E7病毒或AAV/HPV-16 ￡7"94病毒分别或依次 感染或转染单核细胞（Mo)或树突状细胞（DC)得到。8. -种抗HPV-16感染以及由HPV-16感染导致的肿瘤的细胞免疫治疗药物，其活性 成分为权利要求1-4之一所述携带HPV-16ETni94抗原基因的重组腺相关病毒载体（AAV/ HPV-16ETni94)或权利要求6所述与携带HPV-16 ￡7"94抗原基因的重组腺相关病毒载体相关 的产品，包括AAV/HPV-16ETni94质粒、AAV/HPV-16ETni94病毒、被HPV-16ETni94重组腺相关病 毒分别或依次感染或转染得到的单核细胞（Mo)或树突状细胞（DC)。9. 根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述由HPV-16感染导致的肿瘤为HPV-16 E7抗原阳性的宫颈乳头瘤病变、宫颈癌、男性生殖器Bowen's病、巨大尖锐湿痛、阴茎癌、肛 门癌、直肠癌、□腔癌、扁桃体癌以及乳腺癌等。10. -种杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16E7阳性的肿瘤细胞的方法，包括以下步 骤： 1) 将患者体内自然产生的单核细胞被权利要求1-4任一所述携带HPV-16ETni94抗原基 因的重组腺相关病毒载体（AAV/HPV-16ETni94)感染或转染，或被权利要求6所述与本发明 重组腺相关病毒载体相关的产品处理，各自得到处理后的细胞； 2) 将步骤1)中处理后的单核细胞（Mo)诱导的树突状细胞（DC)输入患者体内中，激活 细胞毒性T淋巴细胞（CTL)，该CTL杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16E7阳性的肿瘤细胞； 或将未被处理的T淋巴细胞与所述处理后的Mo-DC混合培养形成HPV-16E7抗原特异性的 CTL，再将该CTL输入患者体内杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16E7阳性的肿瘤细胞；或将 被处理的T淋巴细胞和被处理的Mo-DC输入患者体内中，杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16 E7阳性的肿瘤细胞。
【专利摘要】本发明一种携带HPV-16？E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法，是将具有致瘤性的HPV-16的E7抗原基因突变为无致瘤性的E7抗原基因，再将该突变后基因插入已经剔除结构基因的腺相关病毒载体中而获得的。本发明的重组腺相关病毒可将其携带的突变型抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明，被本发明重组腺相关病毒感染的DC所诱导的CTL可有效地抑制HPV-16E7阳性细胞的生长或者杀灭HPV-16E7阳性的细胞。该重组腺相关病毒载体或其相关产品可被用于制备治疗HPV-16感染及其相关的抗肿瘤药物。
【IPC分类】C12N15/864, A61K48/00, C12N5/10, C12N7/01, A61P35/00, A61P31/20, A61K39/12
【公开号】CN105177047
【申请号】
【发明人】刘勇, 陈巧林, 曾昭鹏, 董文娟, 孟纱, 许艳伟, 张慧, 卢敬
【申请人】广东拓谱康生物科技有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月12日