0 6(c〇pieS)/uL，购自美 国Promega公司。
[0082] 一、重组腺相关病毒（rAAV)的制备
[0083] 图5显示携带HPV-16 ETni94突变基因的重组腺相关病毒（AAV/HPV-16 E7J以及 携带HPV-E7基因的重组腺相关病毒（AAV/HPV-16 E7)的制备方法流程图如图5所示方法 制备重组腺相关病毒（rAAV)。以制备一盘10.0 cm细胞培养皿的病毒为例，当AAV-HEK293 细胞在二氧化碳细胞培养箱中生长至约占培养皿面积70%时，进行如下操作：
[0084] A.按照Lipofectin的使用说明进行操作：将I. 0 μ g rAAV、I. 0 μ g pHelper质粒、 4. OuL Lipofectin和50.0 uL含5%胎牛血清（或小牛血清）的DMEM培养基混匀，室温 静置20分钟。
[0085] B.将混合液加入细胞培养皿中，继续置于二氧化碳细胞培养箱中在37°C下培养。
[0086] C. 72小时后，收获培养皿中的所有细胞和培养液。
[0087] D.剧烈振荡1分钟后，离心，保留上清，即rAAV病毒液。
[0088] E.将收集的rAAV病毒液过滤除菌。
[0089] 二、重组腺相关病毒（rAAV)的病毒滴度测定
[0090] 采用常规的斑点杂交法，对步骤一获得的rAAV病毒进行病毒滴度测定，具体方法 包括以下步骤：。
[0091 ] A.采用常规的DNA苯酚/氯仿提取法，提取rAAV病毒颗粒DNA。
[0092] B.将尼龙膜置于斑点印迹仪中，加入经碱变性的rAAV病毒颗粒DNA，并加入DNA 拷贝数标准，抽真空。
[0093] C.取出尼龙膜干燥后，紫外线固定。
[0094] D.用PCR DIG标记试剂盒并参照试剂盒说明书制备DIG标记的特异性探针，所 用的DNA探针为针对HPV-16 E7基因的特异性探针，探针为"实施例1步骤C中获得的 HPV16-E7 DNA。PCR扩增结束后，对PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下 检测PCR扩增产物，结果出现阳性条带，表明探针标记成功。
[0095] E.用DIG杂交检测试剂盒并参照试剂盒说明书，在杂交炉中对各种rAAV病毒颗粒 DNA进行DNA杂交。
[0096] 实验结果所有rAAV病毒滴度为IO12-IO14拷贝/mL，表明获得的rAAV病毒滴度较 高，完全可用于科学研究和临床实践。
[0097] 实施例3、重组腺相关病毒（AAV/HPV-16 ETni94病毒和AAV/HPV-16 E7病毒）感染 原代宫颈上皮细胞的致瘤性观察
[0098] 材料及其来源：
[0099] A. rAAV病毒：实施例2获得的重组腺相关病毒（AAV/HPV-16 ETni94病毒和AAV/ HPV-16 E7 病毒）。
[0100] B. Keratinocyte-SCF 细胞培养基：购自美国 Life Technology 公司。
[0101] C.原代宫颈上皮细胞：用常规方法从正常的宫颈上皮组织中分离获得。
[0102] 致瘤性观察实验
[0103] 将原代宫颈上皮细胞在放入10.0 cm细胞培养皿中，立即加入IOmL Keratinocyte-SCF细胞培养基，置二氧化碳培养箱中在37°C下培养。待细胞完全贴壁后， 取出培养皿，去除7mL培养液后，按照100M0I剂量分别加入重组腺相关病毒AAV/HPV-16 已7"94病毒或AAV/HPV-16 E7病毒，重置于二氧化碳培养箱。8小时后，取出培养皿，去除培 养液，加入IOmL新鲜的Keratinocyte-SCF细胞培养基，重置于二氧化碳培养箱中在37°C下 培养。每2天更换培养基。每天定时观察细胞形态变化2次。直至细胞出现瘤变。
[0104] 结果如图6所示，两种rAAV均在细胞中表达，但是，被AAV/HPV-16 ETni9^毒感染 的细胞未发生瘤变，表明无致瘤性（三个培养皿从上至下分别加入带CMV启动子、SV40早 期启动子或β蛋白启动子的AAV/HPV-16 Ε7"94病毒）；而被AAV/HPV-16 E7病毒感染的细 胞发生明显瘤变，具有致瘤性（三个培养皿从上至下分别加入带CMV启动子、SV40早期启 动子或β蛋白启动子的AAV/HPV-16 Ε7病毒）。
[0105] 实施例4、肿瘤抗原导入单核细胞-树突状细胞系的杀灭肿瘤实验
[0106] 材料及其来源：
[0107] A. rAAV 病毒：实施例 2 得到的 AAV/HPV-16 ETni94病毒和 AAV/HPV-16 E7 病毒。
[0108] B. A頂-V细胞培养基：购自美国Life Technology公司。
[0109] C.细胞因子：集落细胞刺激因子（GM-CSF)和白细胞介素2、4购自美国R&D公司。
[0110] D.HPV-16 E7阳性的细胞：从肿瘤组织中分离获得或从美国组织细胞保存中心 (ATCC)获得，恶性肿瘤包括宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、阴茎癌细胞、肛门癌细胞和口腔癌细 胞。
[0111] 一、杀灭肿瘤实验
[0112] 图7显示AAV/HPV-16 ETni94感染肿瘤患者树突状细胞为基础的杀灭HPV-16 E7抗 原阳性细胞的实验流程。如图所示，将本发明携带HPV-16 E7或HPV-16 E7"94抗原基因的 rAAV病毒（AAV/HPV-16 Ε7"94病毒或AAV/HPV-16 E7病毒）感染肿瘤患者单核细胞（Mo)为 基础的杀灭HPV-16 E7抗原阳性的细胞实验包括以下步骤：
[0113] A.取肿瘤患者50-150mL外周血，用血细胞分离仪（或淋巴细胞分离液）按常规方 法获取外周血单个核细胞（PBMC)，与A頂-V培养基混匀后，加入细胞培养瓶，置于恒温二氧 化碳培养箱中在37°C下培养2小时。
[0114] B.除去悬浮细胞，保留贴壁细胞（单核细胞）。悬浮细胞即外周血淋巴细胞，将其 与Am-V培养基混匀后，继续培养备用。
[0115] C.加入rAAV病毒，加入量约为100M0I，同时再加入GM-CSF(600IU/mL)，继续培养 4小时。
[0116] D.除去旧培养基，补充含GM-CSF和IL-4(600IU/mL)的A頂-V培养基，继续培养。
[0117] E.培养5天后，收获成熟的树突状细胞（DC)，并与所培养的外周血淋巴细胞混合， 在A頂-V培养基中加入IL-2 (10IU/mL)，继续培养。
[0118] F.培养至7-9天后，收获激活的细胞毒性T淋巴细胞（CTL)进行检测。
[0119] 二、树突状细胞（DC)和细胞毒性T淋巴细胞（CTL)的检测
[0120] A. rAAV感染外周血单核细胞（Mo)的效率检测
[0121] 采用常规的荧光抗体标记染色法，用针对HPV-16 E7特异性荧光抗体（购自美国 BD公司）标记步骤一获得的被本发明rAAV感染的单核细胞（Mo)或未成熟的树突状细胞 (DC)，再进行流式细胞仪检测阳性细胞的数量。其中，rAAV感染单核细胞（Mo)的效率检测 结果如图8所示。携带四种不同启动子（p5、CMVp、SV40p和β-actinp)的AAV/HPV-16 Ε7"94病毒和AAV/HPV-16 Ε7病毒感染Mo的效率均约为90 %，即约百分之九十的Mo可被rAAV病 毒感染，证明本发明的rAAV具有较高的感染效率。
[0122] B.树突状细胞（DC)的⑶分子水平的检测
[0123] DC表达⑶80和⑶86的水平与DC的功能呈正相关。用与步骤A相同的检测方法， 即分别采用荧光标记的针对这二种CD分子的抗体（购自美国BD公司）对步骤一获得的DC 表达CD80和CD86的水平进行检测。AAV/HPV-16 ETni94病毒或AAV/HPV-16 E7病毒感染的 DC表达CD80和CD86水平的检测结果如图9所示（以带CMV启动子的rAAV为代表），该携 带CMV启动子的重组腺相关病毒AAV/HPV-16 ETni9JP AAV/HPV-16 E7感染的DC表达CD80 和CD86水平的流式细胞技术检测结果表明均可获得高水平表达的CD80和CD86,被感染的 DC所表达的CD分子水平较高，证明本发明携带HPV-16 E7或HPV-16 ETni94抗原基因的rAAV 感染的单核细胞所诱导的DC的激发细胞免疫反应的功能强大。
[0124] C.细胞毒性T淋巴细胞（CTL)表达的γ干扰素（IFN-γ)水平的检测
[0125] CTL的功能及其杀伤肿瘤细胞的能力与IFN-γ的表达水平呈正相关。用与步骤A 类似的方法检测被本发明rAAV感染的DC所诱导的CTL表达IFN- γ的水平。DC与外周血 淋巴细胞混合培养结束后，收获细胞，采用传统的胞内染色法进行细胞荧光染色标记，所用 抗体为针对IFN-γ的荧光标记抗体（购自美国BD公司）。最后利用流式细胞仪检测结果。 其中，被AAV/HPV-16 Ε7"94病毒或AAV/HPV-16 Ε7病毒感染的DC所诱导的CTL的IFN-γ表 达水平如图10所示（以带AAV ρ5启动子的rAAV为代表）。该携带AAV ρ5启动子的重组 腺相关病毒AAV/HPV-16 EYnit^PAAVAlPV-Ie Ε7分别感染的树突状细胞（DC)所诱导的细 胞毒性T淋巴细胞（CTL)的的流式细胞技术检测其IFN-γ表达水平结果，为被rAAV感染 的DC所刺激产生的CTL表达IFN- γ的水平较高，证明被本发明AAV/HPV-16 Ε7"94病毒或 AAV/HPV-16 Ε7病毒感染的DC所诱导的CTL杀伤靶细胞的活性较强（功能强大）。
[0126] D.细胞毒性T淋巴细胞（CTL)杀伤肿瘤细胞试验
[0127] 混合培养结束后，将步骤一中被AAV/HPV-16 Ε7"94病毒或AAV/HPV-16 Ε7病毒感染 的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL)按20:1 (淋巴细胞：肿瘤细胞）分别与宫颈癌细 胞、乳腺癌细胞、阴茎癌细胞、肛门癌细胞和口腔癌细胞混合后，采用传统的51Cr(铬-51) 杀伤试验，检测CTL杀伤肿瘤细胞的活性。
[0128] 被rAAV感染的DC所诱导的CTL体外杀伤HPV-16 Ε7阳性细胞的51Cr (铬-51)杀 伤实验结果如图11 (以携带CMV启动子的AAV/