分比浓度或体积/体积（V/V，单位mL/100mL)百分比浓 度。
[0058] 所用引物合成及DNA序列测定均由美国Life Technology公司完成。
[0059] 实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达 到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的 来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提 示替换使用。
[0060] 实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0061] 实施例1、构建重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16 E7和AAV/HPV-16 ETni94
[0062] 一、材料：
[0063] A.四种腺相关病毒（AAV)载体：即分别为具有AAV p5启动子的pAAV/p5、具有巨 噬细胞病毒（CMV)启动子的pAAV/CMVp、具有SV40病毒早期启动子的pAAV/SV40p和具有 人β-肌动蛋白（β-actin)启动子的ρΑΑν/β-actinp。已知的腺相关病毒载体具有p5 启动子，为提高目的基因的转录水平，可将重组腺相关病毒载体中的P5启动子替换为巨噬 细胞病毒（cytomegalovirus，CMV)启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒启动子中的 一个，该四种AAV载体仅启动子不同，其余的基因结构完全相同，即具有AAV 2型两端完整 的重复末端片段（TR)序列，并在两端TR的第75位核苷酸序列处均插入有9个核苷酸片段 (CTGCGCTGG，目的是提高重组AAV病毒（rAAV)的稳定性以及提高病毒的复制效率）、且无任 何AAV结构基因（Rep和Cap)。该四种AAV载体由本专利申请的发明人成功构建（构建方 法参见中国专利ZL201110125683. X)。
[0064] B.人宫颈癌组织：来源于手术切除的宫颈癌癌组织，免疫组化证实HPV-16 E7抗 原阳性。
[0065] C.基因扩增核苷酸引物：根据美国基因库中公开发表的HPV-16 E7基因序 列（美国NCI基因库：KC935953)设计，上游引物：5' -ATGCATGGAGATACA-3'，下游引物： 5' -TTATTGTTTCTGAGAA-3'。
[0066] 二、构建携带人乳头瘤病毒16型（HPV-16)的E7或突变型ETni94S因的重组腺相 关病毒载体
[0067] 用下述方法分别构建本发明携带人乳头瘤病毒16型（HPV-16)的E7或突变型 ETni94基因的重组腺相关病毒载体，其结构示意图如图1(图中"插入的外源性基因"为人乳 头瘤病毒16型（HPV-16)的E7或突变型ETni94基因，启动子分别为AAV的p5启动子、巨噬 细胞病毒（cytomegalovirus，CMV)启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒早期启动子 中的任意一个）所示，具体过程包括以下步骤：
[0068] A.获取 HPV-16 E7 DNA，具体方法为：采用 DNAzol 试剂（美国 Life Technology 公司生产）并按说明书进行操作：首先将HPV-16 E7抗原阳性的宫颈癌组织反复碾磨后， 加入IOmL DNAzol，离心获取上清液后，用75%乙醇洗涤2次，再加入无水乙醇，离心，将沉 淀物用去离子水溶解，将DNA浓度调至IOOng/ μ L。以2 μ L DNA溶液为模板，在上游引物 5' -ATGCATGGAGATACA-3' 和下游引物 5' -TTATTGTTTCTGAGAA-3' 的引导下 PCR 扩增 HPV-16 E7 DNA。PCR扩增条件为：先94°C 4分钟；再94°C 30秒，60°C 35秒，72°C 50秒，共30个循 环；最后72°C 8分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测 结果如图2所示，出现一条长度为297bp与预期结果一致的特异性条带。将该目的条带回 收并纯化后得到长度为297bp HPV-16 E7 DNA。
[0069] B.获取HPV-16 Ε7"94 DNA，具体方法为：采用基因点突变试剂盒（美国 Strategeng公司），按照其试剂盒说明书进行操作：将HPV-16 E7基因（美国NCI基因库： KC935953)开放读码框（nt280)的胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌呤（G)，即将编码半胱氨酸的 tgt (nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt，即获得无致瘤性的突变型HPV-16 E7"94基因。完 成后，进行DNA序列测定，HPV-16 ETni94基因序列如序列表中序列1和图3所示，HPV-16 E7"94基因序列与HPV-16 E7基因序列的比对结果如图3所示（图3中，在nt841位的胸腺嘧啶 (T)被替换为鸟嘌呤（G)，编码半胱氨酸的TGT (nt841-843)改变为编码甘氨酸的GGT)，即获 得无致瘤性的突变型HPV-16 Ε7"94基因，证明基因突变成功，获得HPV-16 E7 "94抗原基因。
[0070] C.获得重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16 E7和AAV/HPV-16 E7-采用DNA连接 技术，分别将上述获得的HPV-16 E7和ETni94DNA片段分别插入pAAV/p5、pAAV/CMVp、pAAV/ SV40p和pAAV/β -actinp这四种rAAV载体中。为插入该基因片段，首先进行酶切反应，然 后进行连接反应。其中，酶切反应体系为：l〇〇ng质粒和50ng HPV-16 E7或ETni94DNA片段； 10U限制性内切酶BamH I和Sal I (购自美国Promega公司），2. 5 μ 1 10 X缓冲液C以及 19. 5 μ 1去离子水；反应条件为：在37°C下水浴4小时。连接反应体系为：50ng酶切后的质 粒，50ng HPV-16 E7 或 HPV-16 ETni94DNA 片段，10IU T4 DNA 连接酶（购自美国 Promega 公 司），1. 5 μ 1 10 X T4DNA连接缓冲液以及11. 5 μ 1去离子水；反应条件为：4°C 8小时。最后 分别得到携带有P5启动子、CMV启动子、SV40早期启动子或β蛋白启动子和HPV-16 Ε7"94基因或HPV-16 Ε7基因的重组腺相关病毒载体，分别对应四种启动子的四种携带HPV-16 已7"94基因的重组腺相关病毒载体统称为AAV/HPV-16 ETni94，四种携带HPV-16 E7基因的重组 腺相关病毒载体统称为AAV/HPV-16 E7。
[0071] D.获得重组腺相关病毒载体质粒AAV/HPV-16 E7和AAV/HPV-16 ETni94Av别将连 接后的AAV/HPV-16 ETni9JP AAV/HPV-16 E7转化基因工程大肠杆菌（E.coli)DH5a感受态 细胞（美国Invitrogen公司），用含100 μ g/mL氨节青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取 白色单菌落，提取质粒并纯化，分别得到AAV/HPV-16 E7"94质粒和AAV/HPV-16 E7质粒。
[0072] F.质粒检测：将获得的AAV/HPV-16 ETni94质粒以限制性内切酶BamH I和Sal I (购 自美国Promega公司）进行酶切分析，以鉴定是否构建成功。酶切反应条件和方法如上述 (二.C)。构建的AAV/HPV-16 Eini94载体的酶切分析结果如图4所示（泳道1-4分别为AAV/ P5/HPV-16 E7n94、AAV/CMVp/HPV-16 E7n94、AAV/SV40p/HPV-16 E7n94、AAV/0-actinp/HPV-16 已7"94)。分析结果表明HPV-16 Eini94基因分别插入携带不同启动子的AAV载体中，携带人乳 头瘤病毒16型突变型ETni94基因的重组腺相关病毒载体构建成功。
[0073] 实施例2、重组腺相关病毒（rAAV)的制备及病毒滴度测定
[0074] 材料及其来源：
[0075] A.实施例1构建的携带HPV-16 Ε7"^Ρ HPV-16 E7抗原基因的重组腺相关病毒载 体（AAV/HPV-16 Ε7η94和 AAV/HPV-16 Ε7)。
[0076] Β.含AAV的Rep基因和Cap基因的辅助质粒pHeIper :由本专利申请的 发明人构建成功（Liu, Y·，Santin AD. ,Mane M·，Chiriva-Internati, M·，Parham GP. , Ravaggi A. , and Hermonatj P. L. Transduction and Utility of the Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Gene into Monocytes and Dendritic Cells by Adeno-Associated Virus. Journal of Interferon and Cytokine Research. 20:21 - 30. 2000) 〇
[0077] C.含有整合于细胞染色体并表达的腺病毒基因 （EU E2A、E4、VAI和VAII基 因）的AAV-HEK293细胞：由本专利申请的发明人建立（Liu，Y.，Santin AD.，Mane M. , Chiriva-Internati, Μ. , Parham GP. , Ravaggi A. , and Hermonatj P. L. Transduction and Util ity of the Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Gene into Monocytes and Dendritic Cells by Adeno-Associated Virus. Journal of Interferon and Cytokine Research. 20:21 - 30. 2000)〇
[0078] D.脂质体转染试剂Lipofectin :购自美国Life Technology公司D
[0079] E. DMEM培养基和胎牛血清（或小牛血清）：购自美国Cellgro公司。
[0080] F. PCR DIG标记试剂盒和DIG杂交检测试剂盒：购自瑞士 Roche公司。
[0081] G.DNA拷贝数标准：分别为IO12拷贝数（C〇pieS)/uL至1