-疏基乙醇，0· ImM 卩1〇^，10%甘油），在冰浴上孵育301^11。然后在12000印111，4°(：条件下离心201^11，最后取出 上层清液转移至DEPC处理过的离心管中，将所得溶液储存在-80°C中备用。
[0073] 步骤三，37°C条件下的检测标准曲线：取7个I. 5mL的灭菌离心管，分别加入终浓 度为87nM复合探针CF-c-Ts，200 μΜ dNTPs，RRI。另外设计7个浓度梯度（14~HOOOcell/ μ L)的端粒酶样品分别加入到以上离心管中37°C恒温孵育lh。在荧光仪上进行检测。并 得到荧光强度和端粒酶浓度的37°C条件下的检测标准曲线，见图3。
[0074] 图3给出了 37°C时，本方法对实验室培养的膀胱癌EJ细胞提取的端粒酶的检测灵 敏度标准曲线。从图3中可知，本发明在37°C时候可以检测到28Cell/yL。
[0075] 另外，如要检测到更低浓度的尿液样品（< Hcell/uL)，则需要改变反应条件，即 需要4°C、14000r/min冷冻离心机离心处理2min，取离心管底部溶液，检测荧光，可得到荧 光强度和细胞数的检测标准曲线。
[0076] 对于未知样品的检测，则需要先在37°C恒温孵育lh，如得不到荧光数据时，则需 要采用离心检测的方案，即4°C、14000r/min离心处理2min，取离心管底部溶液。通过和检 测标准曲线的比对即可得到相对应的样品浓度。
[0077] 步骤四，对于实验方法特异性的验证。我们取了三个已知浓度的待检测样品：含 2800cell/ μ L端粒酶的样品，Control (即不含有端粒酶的样品），含2800cell/ μ L端粒酶 经95°C孵育15min后的样品，含有凝血酶的样品。用步骤二方法检测得到的荧光强度值分 别为：95, 17,19和18。通过与标准曲线对比得知，含2800cell/μ L端粒酶的样品的荧光值 落在37°C条件下的检测标准曲线上。结果说明了我们方法的可应用性以及准确性，见附图 4〇
[0078] 图4给出了本方法检测特异性的柱状图。从图4中可知，当体系中具有活性的端 粒酶存在时，复合探针CF-c-Ts的荧光强度增加，而对于经95°C灭活15min后的端粒酶，或 者凝血酶存在时，复合探针CF-c-Ts的荧光强度保持不变。
[0079] 步骤五，对于实验方法普适性的验证。我们选取从膀胱癌EJ细胞中提取的端粒 酶，经95°C灭活15min后的样品作为control实验。取7个I. 5mL的灭菌离心管，分别加 入终浓度为87nM复合探针CF-c-Ts，200 μΜ dNTPs，RRI。另外分别加入从A375(淋巴癌细 胞）、HeLa (宫颈癌细胞）、!fepG2 (肝癌细胞）、MCF-7 (乳腺癌细胞）、T24 (膀胱癌细胞）、 EJ(膀胱癌细胞）提取的端粒酶和95°C灭活15min的端粒酶至以上7个离心管中37°C恒 温孵育lh，在荧光仪上进行检测。Control组的荧光值为16,而其余细胞系的荧光值均在 70~100范围内。结果说明了我们方法的普适性，见图5。
[0080] 图5给出了本方法检测端粒酶活性的普适性。从图中可以发现，当有端粒酶存在 时，荧光信号均会被放大，且明显高于对照组实验（灭火的端粒酶）的荧光信号。但是不同 的癌细胞提取的端粒酶，彼此之间荧光信号放大不一致，这主要是由于不同的癌细胞的生 长状态、其端粒酶活性不一致，造成引物扩增的片段不一致，从而复合探针CF-c-Ts中DNA 的含量不一致，其亲水性有差别，造成疏水基团CF的聚集程度不一致，所以荧光信号放大 的层度不一致。这些数据说明，我们的方法具有端粒酶检测的普适性。
[0081] 步骤六，实验方法可靠性的验证。我们选取市售的端粒酶活性检测试剂盒作为对 照实验。将从不同数目的膀胱癌EJ细胞中提取的端粒酶分别分成两组，一组用于检测端 粒酶活性并给出标准曲线，另一组用于标准试剂盒，来验证作出的标准曲线，所得的标准曲 线，见图6A，其R2值为0. 9840,说明该标准曲线具有可靠性。另外，通过市售的标准试剂盒 测得的端粒酶活力值，随着癌细胞数目的增加而增加；用我们的复合探针CF-c-Ts来检测 端粒酶活力值时，发现探针的荧光值随着癌细胞数目的增加而增加。结果表明我们的方法 具有可靠性，见附图6B。
[0082] 图6是对实验方法可靠性的验证。红色部分为市售的端粒酶活性检测试剂盒所测 得的端粒酶活力值，随着癌细胞数目的增多，所测得的端粒酶活力值逐步增加。绿色部分为 我们的方法所测得的荧光值，随着癌细胞数目的增多，探针的荧光强度逐步增大。从图中可 以发现，我们的方法在临床应用中具有很好的可靠性。
[0083] 实施例2 :以膀胱癌患者的尿液分离出的细胞的提取物为待测物，来进一步说明 本发明。
[0084] 步骤一：对EJ细胞提取端粒酶（如实施例1，步骤一）。
[0085] 步骤二：将待检测样品和终浓度为87nM复合探针CF-c-Ts，200 μ MdNTPs，RRI加入 到 I. 5mL的灭菌EP离心管中。利用荧光仪进行检测。即可得到细胞数和荧光强度的膀胱 癌EJ细胞检测标准曲线（见附图3)。仪器设置参数不变。
[0086] 步骤三：我们对43例膀胱癌患者尿液分离出的细胞提取的端粒酶和从6例正常 人尿液中分离出的细胞提取的端粒酶进行了验证。利用以上步骤得到的实验结果和膀胱癌 EJ细胞的检测标准曲线对比，我们发现，膀胱癌患者的尿液做检测时，探针的荧光值30~ 100刚好落在膀胱癌EJ细胞检测的标准曲线上。而正常人的尿液做检测时，探针的荧光值 20~30,在膀胱癌EJ细胞检测的标准曲线外。说明我们的方法是可以应用于膀胱癌患者 细胞提取物检测的，见附图7。
[0087] 图7是对膀胱癌患者的尿液中分离出的细胞提取的端粒酶的检测图，红色部分为 癌症患者的检测情况，绿色部分为经95°C灭活15min后的端粒酶的检测情况，从图中可以 发现，我们的方法在临床应用中具有很好的效果。
[0088] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以 限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含 在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于检测端粒酶活性复合探针，其特征在于，该复合探针由聚集猝灭的共辄芴 CF分子与端粒酶引物Ts通过酰胺键结合，为CF-c-Ts，其中，所述端粒酶引物Ts包括如SEQ NO: 1所示的核苷酸序列。2. 如权利要求1所述的复合探针，其特征在于，所述的含有活性酯的共辄芴分子CF的 结构式如式（I)所示：其中，R SC1-C1。的直链烷基。 I-3. 如权利要求2所述的复合探针，其特征在于，R优选为C 6-Cs。4. 一种如权利要求1-3中任一项所述的复合探针的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤：将含有羧基的共辄芴分子先与NHS反应后，再与端粒酶引物反应生成所述的复合探 针。5. -种使用权利要求1-3中任一项复合探针检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所 述方法包括：将所述的复合探针与待测样品接触，并在下述条件下孵育，所述条件足以使在 待测样品中端粒酶的催化下，复合探针上的DNA片段扩增，扩增产物中的疏水材料CF在均 相水溶液中以分散状态存在，释放荧光；对得到的混合物应用检测手段，以读出荧光强度； 其中与不含有待检测细胞的对照或已知数据集相比的荧光强度提供了待测样品中端粒酶 的活性水平。6. 如权利要求5所述的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，在待测样品中端粒酶的 催化下，复合探针上的DNA片段以（TTAGGG)重复片段扩增。7. 如权利要求5所述的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，还包括dNTPs和端粒酶扩 增缓冲溶液。8. 如权利要求5所述的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，该方法的检测下限为 28cell/μ L〇9. 如权利要求5所述的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，该方法尤其适用于膀胱 癌患者的尿液检测。10. -种应用如权利要求5-9中任一项所述的方法检测端粒酶活性的试剂盒。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测端粒酶活性的亲疏水可控的复合探针，以及用该类探针来检测端粒酶活性的方法和试剂盒。本发明的复合探针由共轭芴分子CF与端粒酶引物Ts通过酰胺键结合。通过调控亲水材料在复合探针中的比例，可改变复合探针的亲/疏水性能。在有端粒酶存在时，本发明的复合探针在一定的条件下会以TTAGGG重复片段扩增，扩增产物中的疏水材料CF在均相水溶液中以分散状态存在，释放荧光。将其用荧光仪检测，即可得到不同浓度的端粒酶样品对应的荧光强度。本发明的检测方法制备和操作简单，灵敏度高，检测成本低，所需样品少，响应迅速且特异性好。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11, C12Q1/48, C12N15/10
【公开号】CN105176990
【申请号】
【发明人】夏帆, 贾永梅, 苗茂, 娄筱叮
【申请人】华中科技大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月13日