一种用于端粒酶检测的探针、方法及试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，更具体地，涉及一种亲疏水性可控的复合探针、使用该 探针检测端粒酶的方法以及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 端粒酶（telomerase)是一种自身携带模板的逆转录酶，是由蛋白质和RNA两部分 组成的核糖蛋白复合体。其中RNA部分是一段较短的模板序列，能够与端粒DNA重复序列 (TTAGGG)互补并指导它的合成，而蛋白质部分具有逆转录酶的活性，它能以RNA为模板催 化端粒DNA重复序列的合成，并将其加到端粒的3'端，以维持端粒的长度及功能。端粒酶 在保持基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用。端粒酶在 正常人体组织中的活性被抑制，在肿瘤细胞中被重新激活，研究结果显示在已知的85%的 肿瘤当中都发现了端粒酶的高表达。端粒酶也被认为是癌症早期诊断和靶向治疗的生物标 志物，因此，建立一系列简单、快速、高灵敏度、高选择性、低花费、高通量的策略和技术用于 端粒酶的检测是十分必要的。
[0003] 近十年来，许多研究小组开发了一些新技术和方法用于端粒酶活性的检测。早 在1994年，Kim等就建立了一种超高灵敏度的端粒重复序列扩增方法（telomeric repeat amplification protocol, TRAP)用于端粒酶活性的检测。这种方法主要包括端粒酶引物延 伸反应和端粒重复序列的PCR扩增反应。尽管这种端粒重复序列扩增方法非常有效，大大 提高了端粒酶检测的灵敏度，但是它是基于DNA聚合酶的聚合酶链扩增反应（PCR)，比较费 时，容易受到细胞提取物的抑制出现假阴性结果，而且需要昂贵的仪器和试剂。近年来，广 大科研工作者利用光学表面等离子体共振、电化学、石英晶体微天平等技术开发了一系列 的方法用于端粒酶活性的检测。Willner等首次报导了基于催化脱氧核酶的电化学生物传 感技术用于端粒酶的检测。另有研究报导一种非聚合酶链反应的电化学方法用于端粒酶活 性的检测。该方法主要是通过对端粒重复序列上鸟嘌呤的电化学氧化信号来实现对端粒酶 的检测，这种方法不需要任何标记，在较低蛋白浓度的细胞提取物中都可以检测到端粒酶。 但是这种微分脉冲伏安法的检测范围比较窄，只能从1000个HeLa细胞检测到3000个HeLa 细胞，当样品超过3000个HeLa细胞时，将无法检测到依赖于端粒酶浓度的微分脉冲伏安信 号。同时，有大量文献报道运用荧光信号检测端粒酶活性的方法，但都存在标记复杂或检测 灵敏度、特异性不高的问题。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种亲疏水可调控的复合探 针，利用检测过程中探针亲疏水变化导致其荧光信号变化的性能来实现快速的一步法检测 端粒酶的活性，由此解决现有技术中检测仪器昂贵、实验操作复杂、检测范围窄、灵敏度不 高且实际应用性弱的技术问题。本发明异于一般的荧光检测方法，即检测探针无需荧光分 子、猝灭基团双标记，探针制备更为简单。
[0005] 为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于检测端粒酶活性的亲 疏水性可调控的复合探针，该复合探针由聚集猝灭的共辄芴CF分子与端粒酶引物Ts通过 酰胺键结合，为CF-c-Ts，其中，所述端粒酶引物Ts包括如SEQ NO: 1所示的核苷酸序列。
[0006] 优选地，所述的含有活性酯的共辄芴分子CF的结构式如式（I)所示：
[0007]
其中，R为C1-C10的直链烷基，R优选为C 6-Cs。
[0008] 本发明的一个方面提供了上述复合探针的制备方法，包括以下步骤：将含有羧基 的共辄芴分子先与DCC反应后，再与端粒酶引物反应生成所述的复合探针。
[0009] 本发明的另一个方面提供一种使用上述复合探针检测端粒酶活性的方法，所述方 法包括：将所述的复合探针与待测样品接触，并在下述条件下孵育，所述条件足以使在待测 样品中端粒酶的催化下，复合探针上的DNA片段扩增，扩增产物中的疏水材料CF在均相水 溶液中以分散状态存在，释放荧光；对得到的混合物应用检测手段，以读出荧光强度；其中 与不含有待检测细胞的对照或已知数据集相比的荧光强度提供了待测样品中端粒酶的活 性水平。
[0010] 优选地，在待测样品中端粒酶的催化下，复合探针上的DNA片段以TTAGGG重复片 段扩增。
[0011] 优选地，还包括dNTPs和端粒酶扩增缓冲溶液。
[0012] 优选地，该方法的检测下限为28Cell/yL。
[0013] 优选地，该方法尤其适用于膀胱癌患者的尿液检测。
[0014] 本发明的另一个方面提供了一种上述的方法检测端粒酶活性的试剂盒。
[0015] 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有 益效果：
[0016] (1)现有的端粒酶活性的荧光检测方法，大多需要对探针进行双标，即荧光分子、 猝灭基团标记，运用FRET(荧光共振能量转移）技术实现。本发明的亲疏水可控的复合探 针CF-c-Ts由具有疏水性能的共辄芴分子CF与具有亲水性能的端粒酶引物Ts通过酰胺键 结合而成。当亲水材料DNA (Ts- (TTAGGG) n)在复合探针中所占的比例增加时，复合探针的亲 水性能增强，疏水材料CF在均相水溶液中以分散状态存在，其荧光释放；反之，当亲水材料 DNA在复合探针中所占的比例减小时，复合探针的疏水性能增强，疏水材料CF在均相水溶 液中以聚集状态存在，其荧光自猝灭。端粒酶的活性或数目，直接影响端粒酶引物的扩增程 度，从而使复合探针的亲水性发生不同程度的增加。端粒酶的浓度越大，复合探针CF-c-Ts 扩增的片段越多，亲水材料DNA在扩增产物中所占的比例越大，扩增产物的亲水性能越大， 其荧光越强；反之，当端粒酶的浓度越小，复合探针CF-c-Ts扩增产物的亲水性增加不大， 其荧光变化不大。依据以上原理，本发明的亲疏水性可调控的复合探针制备简单，无需双 标，使得检测成本大大降低，同时降低了检测的背景信号，使信号读取更加方便快捷，提高 了检测的灵敏度、特异性和通用性。
[0017] (2)通过对复合探针的设计，从材料的亲疏水性、空间位阻以及与端粒酶间的结合 等多个方面的角度考虑，进一步优化出最佳的探针分子式，所得到的复合探针在检测端粒 酶活性中灵敏度更高，特异性更好。
[0018] (3)本发明的检测方法简单，无需苛刻的反应条件以及专用仪器，本发明的复合探 针的使用使得检测反应在普通的荧光仪上就可以实现，扩大了方法的使用范围。同时，本发 明的检测方法只需要简单的操作就可以完成端粒酶活性的检测。
[0019] (4)利用复合探针来检测端粒酶的活性，具有高的灵敏度，检测的下限为28cell/ μ L。另外，和金标准TRAP分析方法相比，本发明的检测方法需要的样品量很少，响应迅速 且特异性好，从而避免样品浪费。
【附图说明】
[0020] 图1是本发明中R为C6的烷基链的复合探针的质谱图。
[0021] 图2是本发明的检测方法检测端粒酶的原理图。
[0022] 图3是本发明的检测方法在37°C下端粒酶的检测标准曲线。
[0023] 图4是本发明的检测方法的检测特异性曲线。
[0024] 图5是本发明的检测方法检测癌细胞普适性曲线。
[0025] 图6A是本发明的检测方法获得的标准曲线。
[0026] 图6B是本发明的检测方法检测癌细胞可靠性曲线。
[0027] 图7是本方法检测膀胱癌患者尿液中端粒酶活性的检测曲线。
【具体实施方式】
[0028] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要 彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0029] 本发明提供了一种用于检测端粒酶活性的亲疏水性可调控的复合探针，该复合探 针由聚集猝灭的共辄芴CF分子与端粒酶引物Ts通过酰胺键结合，为CF-c-Ts，其中，所述端 粒酶引物Ts包括如SEQ NO: 1所示的核苷酸序列。
[0030] 优选地，所述的含有活性酯的共辄芴分子CF的结构式如式（I)所示：
其中，R为C1-C1。的直链烷基，R优选为C 6-Cs。
[0032] 本发明的另一个方面提供了上述复合探针的制备方法，包括以下步骤：将含有羧 基的共辄芴分子先与DCC反应后，再与端粒酶引物反应生成所述的复合探针。
[0033] 本发明的复合探针的合成路线为：
[0034] CN 105176990 A 兄明干ι 4/8 页
[0035] 以R为C6H13为例说明本发明的复合探针的制备方法：
[0036] (1)2, 7-二溴-9, 9-二己基芴的合成
[0037] 取2, 7-二溴荷（3. 29g, IOmmol)和四丁基溴化铵（I. 12g