1提取的SPFMV总RNA得到反 应液，然后将反应液于63°C反应60分钟。反应结束后，观察反应液的颜色变化。设置2个 EP管作为重复。
[0076] 按照上述方法，将SPFMV总RNA分别替换为SPVC总RNA、SPVG总RNA、SPLCV总 RNA、SPSMV-I总RNA、SPV2总RNA和灭菌超纯水，其它步骤均不变。反应结束后，观察相应 反应液的颜色变化。
[0077] (2)结果观察和判定：如果反应液的目测颜色为绿色、则待测样品中含有或疑似 含有甘薯羽状斑驳病毒；如果反应液的目测颜色为橙色、则所述待测样品中不含有或疑似 不含有甘薯羽状斑驳病毒。
[0078] 实验结果见图1中B(l、2为灭菌超纯水，3、4为SPLCV，5、6为SPVC，7、8为SPVG， 9、10 为 SPSMV-I，11、12 为 SPFMV，13、14 为 SPV2)。只有加入 SPFMV 总 RNA 的 EP 管进行 RT-LAMP后，反应液为绿色。
[0079] 上述结果表明，本发明提供的检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒可特异的 检测甘薯羽状斑驳病毒。
[0080] 实施例4、实施例2的检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒的灵敏度
[0081] -、以实施例2的检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒C进行灵敏度实验，实 验重复三次，每次重复的步骤如下：
[0082] 1、用 TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (北京六合通经贸有限公司产 品）提取SPFMV总RNA，命名为RNAl。RNAl中RNA的浓度为Ing/ μ 1。
[0083] 2、吸取Iml RNAl加入盛有9ml无菌超纯水中的试管中充分混匀，得到RNA2 ;以此 类推制成RNA3、RNA4、RNA5、RNA6、RNA7和RNA8。使用Beckman UV-800紫外分光光度计测定 稀释后各个梯度的 RNA 浓度，分别为 IOOpg/μ 1、IOpg/μ 1、Ipg/μ IUOOfg/μ 1、IOfg/μ 1、 lfg/ μ 1 和 IOOag/ μ 1。
[0084] 2、RT-LAMP
[0085] (1)向试管中加入24 μ 1反应试剂C和1 μ 1步骤1制备的RNAl得到反应液，然后 将反应液于63°C反应60分钟。以循环数为横坐标，PCR产物的量为纵坐标，得到荧光检测 系统绘制的扩增曲线。设置2个试管作为重复。
[0086] 按照上述方法，将RNAl分别替换为步骤1制备的RNA2、RNA3、RNA4、RNA5、RNA6、 RNA7、RNA8和灭菌超纯水，其它步骤均不变，得到相应的扩增曲线。
[0087] (2)结果观察和判定：如果扩增曲线呈现典型的"S型"、则待测样品中含有或疑似 含有甘薯羽状斑驳病毒；如果扩增曲线呈现为水平直线、则所述待测样品不含有或疑似不 含有甘薯羽状斑驳病毒。
[0088] RT-LAMP 结果表明，向反应试剂中加入 RNAl、RNA2、RNA3、RNA4、RNA5、RNA6 或 RNA7 进行RT-LAMP均得到典型的"S型"扩增曲线，而向反应试剂中加入RNA8或灭菌超纯水进 行RT-LAMP得到的扩增曲线均为水平的直线。表明，本发明提供的检测甘薯羽状斑驳病毒 的RT-LAMP试剂盒对甘薯羽状斑驳病毒RNA的最小检测限为25fg。
[0089] 二、以实施例2的检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒D进行灵敏度实验，实 验重复三次，每次重复的步骤如下：
[0090] 1、用 TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (北京六合通经贸有限公司产 品）分别提取SPFMV总RNA，命名为RNA1。RNAl中RNA的浓度为Ing/ μ 1。
[0091] 2、吸取Iml RNAl加入盛有9ml无菌超纯水中的试管中充分混匀，得到RNA2 ;以此 类推制成RNA3、RNA4、RNA5、RNA6、RNA7和RNA8。使用Beckman UV-800紫外分光光度计测定 稀释后各个梯度的 RNA 浓度，分别为 IOOpg/μ 1、IOpg/μ 1、Ipg/μ IUOOfg/μ 1、IOfg/μ 1、 lfg/ μ 1 和 IOOag/ μ 1。
[0092] 2、RT-LAMP
[0093] (1)向EP管中加入24 μ 1反应试剂D和1 μ 1步骤1制备的RNAl得到反应液，然 后将反应液于63°C反应60分钟。反应结束后，观察反应液的颜色变化。设置2个EP管作 为重复。
[0094] 按照上述方法，将RNAl分别替换为步骤1制备的RNA2、RNA3、RNA4、RNA5、RNA6、 RNA7、RNA8和灭菌超纯水，其它步骤均不变，其它步骤均不变。反应结束后，观察相应反应 液的颜色变化。
[0095] (2)结果观察和判定：如果反应液的目测颜色为绿色、则待测样品中含有或疑似 含有甘薯羽状斑驳病毒；如果反应液的目测颜色为橙色、则所述待测样品中不含有或疑似 不含有甘薯羽状斑驳病毒。
[0096] 实验结果见图2 (1、2为灭菌超纯水，3、4为RNAl，5、6为RNA2，7、8为RNA3，9、10为 RNA4,11、12 为 RNA5,13、14 为 RNA6,15、16 为 RNA7,17、18 为 RNA8)。只有加入 RNA8 或灭菌 超纯水的EP管进行RT-LAMP后，反应液为绿色。结果表明，本发明提供的检测甘薯羽状斑 驳病毒的RT-LAMP试剂盒对甘薯羽状斑驳病毒RNA的最小检测限为25fg。
【主权项】
1. 一种成套引物，由引物SPFMV-F3、引物SPFMV-B3、引物SPFMV-FIP、引物SPFMV-BIP、 引物SPFMV-LF和引物SPFMV-LB组成，各条引物均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列 表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。2. 如权利要求1所述成套引物，其特征在于：所述成套引物中，所述引物SPFMV-F3、所 述引物SPFMV-B3、所述引物SPFMV-FIP、所述引物SPFMV-BIP、所述引物SPFMV-LF和所述引 物SPFMV-LB的摩尔比为 1:1:8:8:4:4。3. 如权利要求2所述成套引物，其特征在于：所述成套引物中，各引物的量如 下：0? 2ymol所述引物SPFMV-F3、0. 2ymol所述引物SPFMV-B3、1. 6ymol所述引物 SPFMV-FIP、L6ymol所述引物SPFMV-BIP、0. 8ymol所述引物SPFMV-LF、0. 8ymol所述引 物SPFMV-LB。 4?权利要求1所述成套引物的制备方法，为如下（I)、（II)或（III): (I)所述成套引物中各条引物分别单独包装； (II)所述成套引物中各条引物按照权利要求2所述比例混合在一起； (III)所述成套引物中各条引物按照权利要求3所述量混合在一起。5. 权利要求1至3中任一所述成套引物的应用，为如下a)或b)或c)或d): a) 制备用于检测或辅助检测甘薯羽状斑驳病毒的试剂盒； b) 检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有甘薯羽状斑驳病毒； c) 制备用于鉴定或辅助鉴定甘薯羽状斑驳病毒的试剂盒； d) 鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的甘薯羽状斑驳病毒。6. 含有权利要求1至3中任一所述成套引物的试剂盒。7. 权利要求6所述试剂盒的应用，为如下e)或f): e) 检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有甘薯羽状斑驳病毒； f) 鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的甘薯羽状斑驳病毒。8. -种检测待测样品是否含有甘薯羽状斑驳病毒的方法，包括如下步骤： 提取待测样品的总RNA，以权利要求1-3中任一所述成套引物进行逆转录环介导等温 扩增，然后进行如下评判：如果所述成套引物可以实现对所述总RNA的逆转录环介导等温 扩增，则待测样品中含有或疑似含有甘薯羽状斑驳病毒；如果所述成套引物不能实现对所 述总RNA的逆转录环介导等温扩增，则所述待测样品不含有或疑似不含有甘薯羽状斑驳病 毒。9. 如权利要求5或7所述的应用，或，权利要求8所述的方法，其特征在于：所述待测 样品为植物样品或微生物样品。10. -种鉴定待测病毒是否为候选的甘薯羽状斑驳病毒的方法，包括如下步骤： 提取待测病毒的总RNA，以权利要求1-3中任一所述成套引物进行逆转录环介导等温 扩增，然后进行如下评判：如果所述成套引物可以实现对所述总RNA的逆转录环介导等温 扩增，则待测病毒为候选的甘薯羽状斑驳病毒；如果所述成套引物不能实现对所述总RNA 的逆转录环介导等温扩增，则所述待测病毒为候选的非甘薯羽状斑驳病毒。
【专利摘要】本发明公开了一种检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒及其专用引物。本发明所提供的检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒的专用引物由引物SPFMV-F3、引物SPFMV-B3、引物SPFMV-FIP、引物SPFMV-BIP、引物SPFMV-LF和引物SPFMV-LB组成，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。实验证明，本发明提供的一种检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒及其专用引物能特异性地检测甘薯羽状斑驳病毒，与其他病毒无交叉反应，对甘薯羽状斑驳病毒的RNA的最小检测限为25fg。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/70
【公开号】CN105176986
【申请号】
【发明人】董杰, 乔岩, 王品舒, 李永强, 岳瑾, 杨建国, 王伟青, 张金良, 袁志强
【申请人】北京市植物保护站
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月12日