一种检测甘薯羽状斑驳病毒的rt-lamp试剂盒及其专用引物的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂 盒及其专用引物。
【背景技术】
[0002] 甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)为 RNA 病毒， 是侵染甘薯的主要病毒之一，分布于世界各甘薯产区，属马铃薯Y病毒科（Potyviridae)、 马铃薯Y病毒属（Potyvirus)。甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus， SPFMV)可与甘薯裡绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus, SPCSV)协生共侵 染甘薯引起甘薯病毒病害（Sweet potato virus disease，SPVD)，为甘薯的一种毁灭性病 害。甘薯感染甘薯病毒病害后，减产可达50%-98%，甚至绝收。目前，检测甘薯羽状斑驳 病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)的方法主要有：ELISA，RT-PCR 等方 法，这些方法的弊端在于耗时长、依赖昂贵的检测设备。
[0003] 近年来开发的环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification, LAMP)是一种新的核酸扩增技术，该技术依赖于能够识别祀序列上6个特 异区域的引物和1个具有链置换特性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)，在等温条件下 高效扩增靶基因，灵敏度和特异性高，该方法已广泛应用于病毒、类病毒、细菌、真菌及转基 因的检测，而迄今尚未应用该技术检测甘薯羽状斑驳病毒的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决技术问题是如何检测甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)〇
[0005] 本发明首先提供了一种成套引物，由引物SPFMV-F3、引物SPFMV-B3、引物 SPFMV-FIP、引物SPFMV-BIP、引物SPFMV-LF和引物SPFMV-LB组成，它们均为单链DNA分子， 核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。其中，序列表 的序列1由20个核苷酸组成，序列表的序列2由21个核苷酸组成，序列表的序列3由43 个核苷酸组成，序列表的序列4由42个核苷酸组成，序列表的序列5由20个核苷酸组成， 序列表的序列6由20个核苷酸组成。所述成套引物可以对甘薯羽状斑驳病毒的总RNA进 行特异性的逆转录环介导等温扩增。
[0006] 所述成套引物中，所述引物SPFMV-F3、所述引物SPFMV-B3、所述引物SPFMV-FIP、 所述引物SPFMV-BIP、所述引物SPFMV-LF和所述引物SPFMV-LB的摩尔比可为 1:1:8:8:4:4〇
[0007] 所述成套引物中，各引物的量如下：0· 2μπιο1所述引物SPFMV-F3、0. 2μπιο1所述 引物 SPFMV-B3、L 6 μ mol 所述引物 SPFMV-FIP、L 6 μ mol 所述引物 SPFMV-BIP、0· 8 μ mol 所 述引物 SPFMV-LF、0. 8 μπιο? 所述引物 SPFMV-LB。
[0008] 所述摩尔比是总摩尔数之比，所述总摩尔数是引物中各种单链DNA摩尔数之和。
[0009] 所述成套引物的制备方法也属于本发明的保护范围。所述成套引物的制备方法可 为如下（I )、（ II )或（III):
[0010] ( I )所述成套引物中各条引物分别单独包装；
[0011] ( II )所述成套引物中各条引物按照所述摩尔比混合在一起；
[0012] (III)所述成套引物中各条引物按照所述量混合在一起。
[0013] 所述成套引物的用途为如下a)或b)或c)或d) :a)制备用于检测或辅助检测甘 薯羽状斑驳病毒的试剂盒；b)检测或辅助检测待测样品中是否含有甘薯羽状斑驳病毒；c) 制备用于鉴定或辅助鉴定甘薯羽状斑驳病毒的试剂盒；d)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否 为候选的甘薯羽状斑驳病毒。
[0014] 本发明还保护所述成套引物的应用，为如下a)或b)或c)或d) :a)制备用于检测 或辅助检测甘薯羽状斑驳病毒的试剂盒；b)检测或辅助检测待测样品中是否含有甘薯羽 状斑驳病毒；c)制备用于鉴定或辅助鉴定甘薯羽状斑驳病毒的试剂盒；d)鉴定或辅助鉴定 待测病毒是否为候选的甘薯羽状斑驳病毒。
[0015] 本发明还保护含有以上任一所述成套引物的试剂盒。所述试剂盒的用途为如下e) 或f) :e)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有甘薯羽状斑驳病毒；f)鉴定或辅 助鉴定待测病毒是否为候选的甘薯羽状斑驳病毒。
[0016] 所述试剂盒还可包括IOX反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、反转录酶和/或甜菜碱。 所述IOX反应缓冲液可为New England Biolabs公司产品。所述反转录酶具体可为M-MLV 反转录酶。
[0017] 所述试剂盒还可包括荧光显色剂。所述荧光显色剂具体可为SYBR Green I核酸 染料或钙黄绿素荧光染料。
[0018] 本发明还保护所述试剂盒的应用，为如下e)或f) :e)检测或辅助检测待测样品中 是否含有或疑似含有甘薯羽状斑驳病毒；f)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的甘薯 羽状斑驳病毒。
[0019] 本发明还提供了一种检测待测样品是否含有甘薯羽状斑驳病毒的方法，包括如下 步骤：
[0020] 提取待测样品的总RNA，以上述任一所述成套引物进行逆转录环介导等温扩增，然 后进行如下评判：如果所述成套引物可以实现对所述总RNA的逆转录环介导等温扩增，则 待测样品中含有或疑似含有甘薯羽状斑驳病毒；如果所述成套引物不能实现对所述总RNA 的逆转录环介导等温扩增，则所述待测样品不含有或疑似不含有甘薯羽状斑驳病毒。
[0021] 所述"检测待测样品是否感染甘薯羽状斑驳病毒的方法"具体可为方法一，包括如 下步骤：提取待测样品的总RNA，以所述检测甘薯羽状斑驳病毒的逆转录环介导等温扩增 成套引物进行环介导等温扩增，如果扩增曲线呈现为典型的"S型"、则待测样品中含有或疑 似含有甘薯羽状斑驳病毒，如果扩增曲线呈现为水平直线、则所述待测样品不含有或疑似 不含有甘薯羽状斑驳病毒。
[0022] 所述"检测待测样品是否感染甘薯羽状斑驳病毒的方法"具体可为方法二，包括如 下步骤：提取待测样品的总RNA，以所述检测甘薯羽状斑驳病毒的逆转录环介导等温扩增 成套引物进行环介导等温扩增（反应体系中含有钙黄绿素荧光染料），得到待测样品反应 液，目测待测样品反应液的颜色变化，如果待测样品反应液为绿色、则待测样品中含有或疑 似含有甘薯羽状斑驳病毒，如果待测样品反应液为橙色、则所述待测样品中不含有或疑似 不含有甘薯羽状斑驳病毒。
[0023] 本发明还保护一种鉴定待测病毒是否为候选的甘薯羽状斑驳病毒的方法，包括如 下步骤：
[0024] 提取待测病毒的总RNA，以上述任一所述成套引物进行逆转录环介导等温扩增，然 后进行如下评判：如果所述成套引物可以实现对所述总RNA的逆转录环介导等温扩增，则 待测病毒为候选的甘薯羽状斑驳病毒；如果所述成套引物不能实现对所述总RNA的逆转录 环介导等温扩增，则所述待测病毒为候选的非甘薯羽状斑驳病毒。
[0025] 所述"鉴定待测病毒是否为甘薯羽状斑驳病毒的方法"具体可为方法三，包括如下 步骤：提取待测样品的总RNA，以所述检测甘薯羽状斑驳病毒的逆转录环介导等温扩增成 套引物进行环介导等温扩增，如果扩增曲线呈现为典型的"S型"、则待测病毒为候选的甘薯 羽状斑驳病毒，如果扩增曲线呈现为水平直线、则所述待测病毒为候选的非甘薯羽状斑驳 病毒。
[0026] 所述"鉴定待测病毒是否为甘薯羽状斑驳病毒的方法"具体可为方法四，包括如下 步骤：提取待测样品的总RNA，以所述检测甘薯羽状斑驳病毒的逆转录环介导等温扩增成 套引物进行环介导等温扩增（反应体系中含有钙黄绿素荧光染料），得到待测样品反应液， 目测待测样品反应液的颜色变化，如果待测样品反应液为绿色、则待测病毒为候选的甘薯 羽状斑驳病毒，如果待测样品反应液为橙色、则所述待测病毒为候选的非甘薯羽状斑驳病 毒。
[0027] 上述任一所述钙黄绿素焚光染料可为向IOOmg 钙黄绿素 （Thermo fisher公司产 品，产品目录号为S-34854)中加入100mL生理盐水得到的染料。
[0028] 上述任一所述环介导等温扩增可在60_65°C条件下进行。更具体可在63°C条件下 进行。
[0029] 上述任一所述待测样品可为植物样品或微生物样品。所述待测样品具体可为未感 染甘薯羽状斑驳病毒的健康甘薯叶片或感染甘薯羽状斑驳病毒的甘薯叶片。
[0030] 上述任一所述待测病毒可为甘薯羽状斑驳病毒、甘薯C病毒、甘薯G病毒、甘薯卷 叶病毒、甘薯病毒2号、或甘薯无症病毒1。
[0031] 实验证明，本发明提供的一种检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒及其专用 引物能特异性地检测甘薯羽状斑驳病毒，而且与其他病毒无交叉反应，如甘薯卷叶病毒、甘 薯C病毒或甘薯G病毒。同时，本发明提供一种检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒 及其专用引物对甘薯羽状斑驳病毒的RNA的最小检测限为25fg。
【附图说明】
[0032] 图1为检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒的特异性。
[0033] 图2为检测甘薯羽状斑驳病毒的RT-LAMP试剂盒的灵敏度。
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