B)中的亮度高，表明hdvr和BGHpA的加入有利于西门利克森林病毒复制子高效表达外源蛋白。
[0062]实施例4:制备缺失病毒衣壳蛋白基因且携带EGFP基因的西门利克森林病毒的亚克隆
[0063]以 pSFV_helper2 (Berglund, P et al., (1993) B1technology 11，916-920.)为模板分别扩增序列 SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21 和 SEQ ID N0:28，使用 SEQID N0:22 和 SEQ ID NO:23 所示引物扩增片段 SEQ ID N0:19;使用 SEQ ID N0:24 和 SEQID NO:25所示引物扩增片段SEQ ID NO:20 ;使用SEQ ID N0:26和SEQ ID N0:27所示引物扩增片段SEQ ID N0:21;使用SEQ ID N0:29和SEQ ID NO:30所示引物扩增片段SEQ IDNO:28 ;按常规方式检测回收扩增出的DNA片段。
[0064]PCR 的反应体系均为 50 μ I:5 X React1n Buffer:10 μ 1，1mM dNTPs:1 μ 1，10 μM Forward Primer:2.5 μ 1,10 μM Reverse Primer:2.5 μ 1，Template DNA:0.5 μ 1，DNA Polymerase:0.5 μ 1，Nuclease-Free Water:33 μ I ο 扩增条件为:98°C 60s，98°C 10s，55°C 15s,72°C 20s, 72°C 1min, 16°C 10min，30 个循环；
[0065]使用ApaI 和 NruI 酶切 Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA，然后米用 Vazyme 同源重组试剂盒将片段 SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21 和 SEQ ID NO: 28 插入到Ubc-SFV-r印licon-EGFP-hdvr-BGHpA，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-FL-EGFP- Δ C，其序列为 SEQ ID NO:31 所示。
[0066]实施例5:
[0067]复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆在制备复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒中的应用:
[0068]按照实施例2中的转染方法，将质粒Ubc-SFV-FL-EGFP- Λ C转染BHK-21细胞，I天后可观察到绿色荧光蛋白(图4Β)，可见到成团的绿色荧光蛋白，表明产生了具有感染性的亚病毒颗粒，收集上清加入到新鲜制备的ΒΗΚ-21细胞，可以见到绿色荧光的表达，表达具有成簇的特点，再次收集上清感染新鲜制备的ΒΗΚ-21细胞，可以见到绿色荧光的表达(图4Β)，由此可见，该方法成功制备出了缺失衣壳后，仍可以包装病毒基因组的病毒样颗粒。
[0069]实施例6:
[0070]复制耐受型的西门利克森林病毒病的毒样颗粒的特征
[0071]为了分析复制耐受型病毒样颗粒的特征，一方面进行电镜分析其病毒的形状和大小，另一方面分析其在ΒΗΚ-21细胞上产生的空斑的情况。
[0072]①吸取病毒液体10 μ I到干净的封口膜上，将铜网正面向下，置于样品表面孵育3-5min ;用干净滤纸吸除多余液体，并将铜网浸入染色液染色3min ;用干净滤纸吸除多余液体，将铜网铺在干净的滤纸片上，放入玻璃平皿待干燥后作透射电镜观察。可见到复制耐受型病毒样颗粒的直径较小(图6C)
[0073]②取病毒液体15 μ I置于135 μ IDMEM(含有2% FBS)的稀释液中，依次10倍比西施。然后分别在每个稀释度取100 μ I加入到含有ΒΗΚ-21细胞(汇合度95% )中，置于37°C，C025%的培养箱中I小时，然后加入吸弃病毒液，加入浓度为0.6%的琼脂(含有2%FBS和IX的DMEM)，2天后加入含有中性红且浓度为0.6%的琼脂(含有2% FBS和IX的DMEM，)。24小时后可以看见斑点为针尖状(图6A和B)
[0074]最后，还需要注意的是，上述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，并且以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆，其序列为SEQID N0:31o2.复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的制备方法，包括:(1)制备依赖启动子的而无需体外转录的高效复制子系统，(2)制备缺失病毒衣壳蛋白基因的亚克隆。3.权利要求1所述亚克隆的制备方法，包括: 1)构建Ubc启动子驱动的的西门利克森林病毒复制子: 使用PvuI和EcoRV酶切pSFV-replicon，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQID NO: 1，SEQ ID N0:4和SEQ ID NO: 7片段插入到pSFV_r印I icon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-repIicon ； 2)构建携带EGFP基因的西门利克森林病毒复制子: 使用BamHI和XhoI酶切Ubc-SFV-r印I icon，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO: 10片段插入到以SFV复制子质粒Ubc-SFV-r印licon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc_SFV_repIicon-EGFP ； 3)构建高效表达EGFP的西门利克森林病毒复制子 使用ApaI和NruI酶切Ubc-SFV-replicon-EGFP，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 18片段插入到Ubc_SFV_r印licon-EGFP，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-repIi con-EGFP-hdvr-BGHpA ； 4)制备缺失病毒衣壳蛋白基因且携带EGFP基因的西门利克森林病毒的亚克隆 使用 ApaI 和 NruI 酶切 Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHpA，然后米用 Vazyme 同源重组试剂盒将片段 SEQ ID NO: 19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21 和 SEQ ID N0:28 插入到 Ubc-SFV-r印licon-EGFP-hdvr-BGHpA，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-FL-EGFP- Δ C，其序列为SEQ ID NO:31 所示。4.复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆在制备复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒中的应用。5.利用权利要求1所述的亚克隆制备的复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒。6.权利要求5所述的病毒样颗粒的应用； 所述的应用为蛋白表达、基因治疗、神经细胞精细形态的描绘、神经环路的解析、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位分析、病毒抗体药物筛选、疫苗、诊断试剂、动物模型的建立或病毒复制与致病机制研究中的应用。
【专利摘要】本发明公开了复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用，其亚克隆的序列为SEQ？ID？NO.31所示。复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的制备方法包括（1）制备依赖启动子但无需体外转录的高效复制子系统，（2）制备缺失病毒衣壳蛋白基因的亚克隆。利用该亚克隆制备出的复制耐受型的病毒样颗粒，可用于蛋白表达、基因治疗、神经细胞精细形态的描绘、神经环路的解析、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位分析、病毒抗体药物筛选、疫苗、诊断试剂、动物模型的建立或病毒复制与致病机制研究。
【IPC分类】G01N33/569, C12Q1/70, A61K48/00, C12N7/00, A61P31/14, A61K39/12
【公开号】CN105176936
【申请号】
【发明人】贾凡, 徐富强
【申请人】中国科学院武汉物理与数学研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月23日