复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，更具体涉及复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]西门利克森林病毒(Semliki forest virus，SFV)属于披膜病毒科甲病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为12kb。基因组编码的多聚蛋白可切割成5个结构蛋白(C、E3、E2、6K和El)和4个非结构蛋白(nsPl、nsP2、nsP3和nsP4)。非结构蛋白参与病毒的复制和包装等过程，而结构蛋白参与病毒粒子的组装。西门利克森林病毒具有广泛的宿主范围，且能够感染神经系统。病毒作为一种微生物，一方面对人类的健康和农业生产产生不利的影响，另一方面，病毒的感染特性使得其具有为人类所利用的能力，从而为人类的健康和农业生产服务。因此，必须充分了解病毒的生物学特性，才能够有得放矢去改造病毒。
[0003]随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本发明分别采用不同的技术途径获得了一种具有复制耐受型的西门利克森林病毒样颗粒。将在蛋白表达、基因治疗、疫苗和诊断试剂的研发、神经细胞和非神经细胞精细形态的描绘、灵长类和非灵长类解析脑神经环路、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值和前景。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供了一种复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆，其序列为SEQ ID N0.31所示，该亚克隆可用于西门利克森林病毒病毒样颗粒的制备。
[0005]本发明的另一个目的在于提供了一种复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的制备方法，方法简单。
[0006]本发明还有一个目的在乎提供了复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆在制备复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒中的应用，制备出的病毒样颗粒在蛋白表达、基因治疗、神经细胞精细形态的描绘、神经环路的解析、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。
[0007]为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案:
[0008]复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆，其序列为SEQ ID N0.31所示。
[0009]复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的制备方法，包括:(1)制备依赖启动子的而无需体外转录的高效复制子系统，(2)制备缺失病毒衣壳蛋白基因的亚克隆。
[0010]SEQ ID N0.31所示的复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆，包括以下步骤:
[0011]1.构建Ubc启动子驱动的的西门利克森林病毒复制子:
[0012]使用PvuI 和 EcoRV 酶切 pSFV-repl icon (Berglund, P et al., (1993)B1technologyll，916-920.)，然后采用 Vazyme 同源重组试剂盒将 SEQ ID NO:1, SEQ IDN0:4和SEQ ID N0:7片段插入到？3?￥1印1化011，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon。
[0013]2.构建携带EGFP基因的西门利克森林病毒复制子:
[0014]使用BamHI和XhoI酶切Ubc-SFV_replicon，然后米用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO: 10片段插入到以SFV复制子质粒Ubc-SFV_replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-repIicon-EGFP。
[0015]3.构建高效表达EGFP的西门利克森林病毒复制子
[0016]使用ApaI和NruI酶切Ubc-SFV-replicon-EGFP，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 18片段插入到Ubc_SFV_r印licon-EGFP，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为 Ubc-SFV-repIicon-EGFP-hdvr-BGHpA。
[0017]4.制备缺失病毒衣壳蛋白基因且携带EGFP基因的西门利克森林病毒的亚克隆
[0018]使用ApaI 和 NruI 酶切 Ubc-SFV-replicon-EGFP-hdvr-BGHp，然后米用 Vazyme 同源重组试剂盒将片段 SEQ ID NO: 19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21 和 SEQ ID N0:28 插入到Ubc-SFV-r印licon-EGFP-hdvr-BGHp，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-FL-EGFP- Δ C，其序列为SEQ ID NO:31所示。
[0019]本发明提供的复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的制备方法也适合于与西门利克森林病毒同科的病毒的构建，例如委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equineencephalitis virus, VEEV)和辛德毕斯病毒(Sindbis virus, SINV) ο
[0020]复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆在制备复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒中的应用，包括将Ubc-SFV-FL-EGFP- Δ C通过脂质体转染进BHK-21细胞制备复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒，制得的病毒样颗粒利用常规方法，可用于蛋白表达、基因治疗、神经细胞精细形态的描绘、神经环路的解析、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析。
[0021]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
[0022]1.本发明提供了一种高效、便捷的制备复制耐受型的西门利克森林病毒样颗粒的方法，该平台制备的病毒具有可视化的特点，便于开展相关的研究。目前国内外还没有基于该系统的平台，本发明填补了该空白。
[0023]2.本发明对于开展SFV的应用性研究(如蛋白表达、基因治疗、细胞精细结构描绘、神经环路标记、药物筛选、抗原表位分析、新型疫苗和诊断试剂等)和基础性研究(如复制、包装盒致病机制等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值。
[0024]3.本发明制备出的复制耐受型的病毒样颗粒表明西门利克森林病毒的膜蛋白能够形成病毒样的颗粒，并且该颗粒具有包装病毒核酸的能力，这种包装是通过病毒样颗粒识别位于病毒nsP2基因中的包装序列。
[0025]4.野生病毒由于含有病毒衣壳蛋白，因此具有很强的核酸包装能力，病毒的产生的效率高，因此毒性较大。而本发明制备的病毒样颗粒包装核酸的效率低，具有完成病毒生命循环的能力，该病毒样颗粒的毒性小，有利于该系统的应用。
【附图说明】
[0026]图1为一种依赖于Ubc启动子的西门利克森林病毒的复制子的构建示意图。
[0027]pSFV-repl icon的SP6启动子被真核启动子Ubc启动子取代。更具体而言，采用的EcoRV和PvuI作为酶切位点，将该Ubc启动子的序列引入到pSFV-repl icon，而制备了Ubc-SFV-rep I icon ο SP6启动子是用来进行复制子体外转录，而Ubc启动子则不需要进行体外转录为RNA，只需将该质粒DNA转染到细胞内，即可在Ubc的驱动下完成转录。该策略大大方便了实验流程。
[0028]图2为一种依赖于Ubc启动子的表达EGFP的西门利克森林病毒的复制子。
[0029]A:一种依赖于Ubc启动子的表达EGFP的西门利克森林病毒的复制子的构建示意图；
[0030]B:一种依赖于Ubc启动子的表达EGFP的西门利克森林病毒的复制子的DNA转染BHK-21细胞后的荧光表达情况；
[0031]图3为一种高效表达EGFP的西门利克森林病毒复制子。
[0032]A:一种依赖于Ubc启动子的高效表达EGFP的西门利克森林病毒的复制子的构建示意图；
[0033]B:表达EGFP的复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的DNA