转染BHK-21细胞后的焚光表达情况。
[0034]图4为一种表达EGFP的复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒的制备。
[0035]A:一种缺失病毒衣壳蛋白基因的依赖于Ubc启动子的表达EGFP的西门利克森林病毒的亚克隆的构建示意图；
[0036]B:表达EGFP的复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆的DNA转染BHK-21细胞后的焚光表达情况。
[0037]图5为一种复制耐受型西门利克森林病毒病毒样颗粒通过识别位于nsP2的包装序列而包装核酸。
[0038]A:一种包装序列缺失的制备西门利克森林病毒病毒样颗粒的构建示意图；
[0039]B:缺失包装序列的表达EGFP的复制耐受型的西门利克森林病毒的亚克隆转染BHK-21细胞后的荧光表达情况。
[0040]图6为一种表达EGFP的复制耐受型西门利克森林病毒样颗粒的生物学特征的分析。
[0041]A:一种表达EGFP的复制耐受型西门利克森林病毒样颗粒的空斑形成特征(染色)；
[0042]B:一种表达EGFP的复制耐受型西门利克森林病毒样颗粒的空斑的荧光成像；
[0043]C:一种表达EGFP的复制耐受型西门利克森林病毒样颗粒的电镜特征；
【具体实施方式】
[0044]本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。
[0045]实施例1:
[0046]构建Ubc启动子驱动的的西门利克森林病毒复制子:
[0047]为了将Ubc启动子插入到复制子的3’ UTR的上游，需要采用三片段同源重组的方法进行。(I)采用全基因序列合成的方法合成Ubc启动子，其序列为SEQ ID N0:1，为了大量获取Ubc启动子的产物，使用SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示引物扩增片段SEQ ID NO:1 ；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段；(2)以？5?￥^印1化011为模板，扩增I inker I，其序列为 SEQ ID NO:4，采用引物 SEQ ID NO: 5 和 SEQ ID NO:6 ； (3)以口5?￥1印1化011为模板，扩增 linker2，其序列为 SEQ ID NO: 7，采用引物 SEQ ID NO: 8 和 SEQ ID NO: 9 ；
[0048]PCR 的反应体系均为 50 μ I:5 X React1n Buffer:10 μ 1，1mM dNTPs:1 μ 1，10 μM Forward Primer:2.5 μ 1,10 μM Reverse Primer:2.5 μ 1，Template DNA:0.5 μ 1，DNA Polymerase:0.5 μ 1，Nuclease-Free Water:33 μ I ο 扩增条件为:98°C 60s，98°C 10s，55°C 15s,72°C 90s, 72°C 1min, 16°C 10min，30 个循环；
[0049]使用PvuI 和 EcoRV 酶切 pSFV-repl icon (Berglund, P et al., (1993)B1technologyll, 916-920.)，然后采用 Vazyme 同源重组试剂盒将 SEQ ID NO:1, SEQ IDN0:4和SEQ ID N0:7片段插入到？3?￥1印1化011，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-replicon。
[0050]pSFV-replicon的SP6启动子被真核启动子Ubc启动子取代。更具体而言，采用的EcoRV和PvuI作为酶切位点，将该Ubc启动子的序列引入到pSFV-repl icon，而制备了Ubc-SFV-rep I icon ο SP6启动子是用来进行复制子体外转录，而Ubc启动子则不需要进行体外转录为RNA，只需将该质粒DNA转染到细胞内，即可在Ubc的驱动下完成转录。该策略大大方便了实验流程。构建示意图见图1。
[0051]实施例2:构建携带EGFP基因的西门利克森林病毒复制子，其构建方法如下:
[0052]以pEGFP-N2 (Invitrogen公司)为模板扩增EGFP基因，其序列为SEQ ID NO: 10，使用SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示引物扩增片段SEQ ID NO: 10 ;按常规方式检测回收扩增出的DNA片段。
[0053]PCR 的反应体系均为 50 μ I:5 X React1n Buffer:10 μ 1，1mM dNTPs:1 μ 1，10 μM Forward Primer:2.5 μ 1,10 μM Reverse Primer:2.5 μ 1，Template DNA:0.5 μ 1，DNA Polymerase:0.5 μ 1，Nuclease-Free Water:33 μ I ο 扩增条件为:98°C 60s，98°C 10s，55°C 15s,72°C 60s, 72°C 1min, 16°C 10min，30 个循环；
[0054]使用BamHI和XhoI酶切Ubc-SFV_replicon，然后米用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO: 10片段插入到以SFV复制子质粒Ubc-SFV_replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为Ubc-SFV-repIicon-EGFP。
[0055]使用Lipofectamine2000作为转染试剂将质粒DNA转入BHK-21细胞。具体而言，分为两个步骤:I)取2只1.5ml离心管，分别向其加入250 μ I的Opt1-ΜΕΜ，向其中一只加入2ug质粒Ubc-SFV-FL-EGFP- Δ C，向另一只加入5 μ I转染试剂，室温放置5min后，将两者混匀，置于室温放置20min ;2)吸弃长满单次细胞的6孔板中的培养基，用PBS洗两次，吸弃PBS，然后加入Iml Opt1-MEM，将步骤I中的混合液(500 μ I)立刻加入到孔中，混匀后置于37°C，5% CO2的细胞培养箱中，4h后吸弃培养基，加入2ml含有2% FBS的DMEM培养基。
[0056]Ubc-SFV-replicon-EGFP质粒转染BHK2-21后I天可观察到绿色荧光蛋白(图2B)，表明西门利克森林病毒复制子不需要通过体外转录为RNA后再转染BHK-21细胞，简化了实验的操作步骤。
[0057]实施例3:构建高效的携带EGFP基因的西门利克森林病毒复制子
[0058]将hdvr和BGHpA的序列插入到pUbc-SFV-replicon-EGFP的下游。采用基因合成的方法，合成hdvr-BGHpA的片段，其序列为SEQ ID N0:13。为了大量获取hdvr-BGHpA的产物，使用SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15所示引物扩增片段SEQ ID NO: 13;以pSFV-r印licon为模板，使用SEQ ID N0:16和SEQ ID NO: 17所示引物扩增片段SEQ IDNO: 18 ;按常规方式检测回收扩增出的DNA片段。
[0059]PCR 的反应体系均为 50 μ I:5 X React1n Buffer:10 μ 1，1mM dNTPs:1 μ 1，10 μM Forward Primer:2.5 μ 1,10 μM Reverse Primer:2.5 μ 1，Template DNA:0.5 μ 1，DNA Polymerase:0.5 μ 1，Nuclease-Free Water:33 μ I ο 扩增条件为:98°C 60s，98°C 10s，55°C 15s,72°C 60s, 72°C 1min, 16°C 10min，30 个循环；
[0060]使用ApaI和NruI酶切Ubc-SFV-replicon-EGFP，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 18片段插入到Ubc_SFV_r印licon-EGFP，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为 Ubc-SFV-repIicon-EGFP-hdvr-BGHpA。
[0061 ] 按照实施例2中的转染方法将质粒Ubc-SFV-RpI icon-EGFP-hdvr-BGHpA转染BHK-21细胞，I天后观察到绿色荧光蛋白(图3B)，表达的荧光密度比(图2