I级：软便，不成形，少量粪质，有黏液和脓，每天排泄次数超过30次。
[0204] I级：颗粒状粪便，膨大松软，偶见脓头，每天排泄次数超过20次。
[0205] 0级：正常，健康小鼠粪便颗粒，每天排泄10~20次。
[0206] 3、益生菌治疗
[0207] (1)混合益生菌的制备
[0208] 益生菌菌株B. Iongum HB25和L. acidophilus HL9分别在乳酸菌MRS增菌肉汤 培养基中37°C、200rpm厌氧培养24小时后收集菌落，比色后，用生理盐水调整细菌浓度 3 X 10sCFU/mL的菌悬液，然后将两种菌悬液按体积比1:1进行混合，制成3 X 10sCFU/mL的 混合制剂。
[0209] (2)动物给药分组
[0210] 建模成功的SPF级BALB/c小鼠随机分为抗生素处理组和益生菌治疗组。对照组 仍然灌胃无菌生理盐水连续7d ;抗生素处理组给予生理盐水7d ;益生菌组小鼠灌胃浓度为 0. 5mL3X 108CFU/kg/day 菌悬液。
[0211] 4、检测
[0212] 小鼠粪便收集时间点为第0d、第5d和第12d。最后将SPF级BALB/c小鼠脱颈椎处 死，取实验小鼠结肠组织用于病理切片的制备。结肠组织的病理切片：脱颈椎处死小鼠后， 取结肠样I X Icm2，置于滤纸片上小心裁开，轻微冲洗后，腔面朝向滤纸面，在中性甲醛溶液 进行固定，石蜡包埋，切片机切片完毕后考片脱蜡，使用常规Η/E染色，染色后在光镜下观 察并做图像分析处理。
[0213] 5、肠道细菌微生物区系的DGGE分析
[0214] 16SrDNA V6-V8 区的引物：
[0215] V6-V8 引物 F:
[0216] U968-5,-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTT AC-3，；
[0217] V6-V8 引物 R :L1401-5, -CGGTGTGTACAAGACCC-3' ；
[0218] CN 105176857 A 说明书 19/21 页
[0219] 扩增结束后，对PCR扩增的产物进行DGGE凝胶电泳分析。DGGE使用8 %聚丙烯酰 胺凝胶，变性梯度为35%~60% (将100%变性梯度定义为包含40% (v/v)甲酰胺和7mol/ L尿素），电泳缓冲液为IXTAE Buffer。电泳采用DCode?变性梯度凝胶电泳仪（Bio-Rad， USA)，首先在电泳槽中添加新配置的电泳缓冲液，打开电泳仪预热到60°C ;并向加样孔中加 入PCR扩增产物，打开电源在220V电压下进行10分钟的预电泳，随后在85V的固定电压下 电泳16h。电泳结束后，进行硝酸银染色和定显影，洗涤，放于干净的玻璃板上，自然晾干并 照相。电泳后的凝胶胶带采用Quantity 0ne(BioRad，美国）进行条代数、多样性及UPGMA 相似性聚类分析。
[0220] 6、组织切片
[0221] 由二氧化碳麻醉和斩首处死小鼠，收集结肠组织。新鲜结肠组织小切片立即固定 在含有10%的福尔马林缓冲液中并包埋在石蜡。石蜡包埋的组织进行切片（5 μm)和安装 用于组织染色。使用带一系列的二甲苯去除固定剂，再水化，然后在去离子水洗15分钟，以 除去任何残留的固定液。组织切片随机选取苏木精伊红（Η/E)染色，并由两位有经验的实 验观察员在光学显微镜下观察并记录（Olympus，日本）。
[0222] 7、统计学分析
[0223] 所有数据以平均数M土标准方差【表示。用SPSS 17. 0软件进行数据结果的统 计学分析，组间比较采用t检验，P〈0. 05的值表示为对比组差异具有显著性的统计学意义， P〈〇. 01的值表示为对比组差异具有极显著性的统计学意义。
[0224] 三、实验结果
[0225] 1、模型建立
[0226] 抗生素处理小鼠6天后，小鼠体重出现显著性变化，随着处理时间的增长，小鼠体 重逐渐减轻，小鼠的体重从刚开始的20. 73±0. 21g减少到18. 07±0. 37g，而对照组小鼠 体重则增加，从20. 75±0. 17g增加至23. 46±0. 24g，造模4天小鼠体重变化更加明显见 表7。说明抗生素处理小鼠能够引起小鼠体重的变化，引起小鼠腹泻的产生。并且收集到 的小鼠粪便样品含水量较正常小鼠显著增加，呈稀软状，而且小鼠表现出毛发无光泽、饮食 减少、粘液稀便等腹泻常见症状，证实实验中的抗生素确实能够造成小鼠腹泻，说明造模成 功；但是当服用益生菌后，小鼠的腹泻症状改善，益生菌灌胃第10天小鼠稀便率得到显著 缓解与抗生素处理组相比，结果见表8,随着益生菌的治疗作用，小鼠的腹泻数量显著减少 了。与抗生素处理组小鼠相比，在12天的时候小鼠有8只小鼠表现为轻度腹泻或者无腹泻 发生。
[0227] 表7抗生素处理小鼠后的体重变化
[0231] 2、肠道菌群的变化
[0232] 抗生素处理6天后，小鼠肠道菌群出现重度失衡，肠道的总厌氧菌从 8. 87±0· 171og1QCFU/g减少到4. 13±0· 151og1QCFU/g，乳酸杆菌从7. 82±0· 331og1QCFU/g 明 显减少到2. 35±0. 231og1(]CFU/g，而且双歧杆菌则没有检测到在抗生素处理后（P〈0. 01)， 与对照组比较，益生菌组小鼠肠道肠球菌数量显著减少，而且检测不到（P〈〇. 01)，相反肠杆 菌的数量则增加在抗生素组中，（图4)。当给予小鼠灌胃益生菌（IO9CFUAiL)处理后，小 鼠粪便中的厌氧总菌均得以恢复到10. 08±0. 361og1QCFU/g，同时均出现肠球菌逐渐增多 的现象，双歧杆菌（8. 87±0. 171og1QCFU/g)和乳杆菌（7. 54±0. 351og1QCFU/g)也得以恢复 (Ρ〈0· 05) 〇
[0233] 3、肠道细菌微生物区系的DGGE分析
[0234] 基因组DNA的V6-V8区引物PCR-DGGE分析表明，大剂量抗生素灌胃处理（抗生 素组）后，小鼠粪便微生物区系的优势菌群发生变化，见图5,与Control组（对照组）相 比，DGGE图谱的条带数显著减少（P〈0. 01)，肠道菌群的多样性指数和丰富度均极显著低 于Control组（P〈0. 01)，见表9。抗生素小鼠灌胃组，粪便细菌菌群整体的多样性和细菌 种类明显减少，分别从31. 73±1. 59减少到26. 45±0. 83,3. 43±0. 05到3. 09±0. 04。大 剂量抗生素灌胃处理后，使用B. Iongum HB25和L. acidophilus HL9益生菌策略对小鼠肠 道菌群进行调整，经过V6-V8区引物的PCR-DGGE分析，我们得出使用益生菌对菌群失调小 鼠调节，其肠道微生物数量增加，且菌群的丰富度得到恢复，分别从33. 45±0. 79增加到 26. 45±0. 83且高于正常处理组（P〈0. 05)(表9)。相似性聚类分析结果表明，益生菌治疗 组（Probiotics)小鼠（72% )与抗生素处理菌群重度失衡组小鼠（63% )的差异明显，而 与对照组（74%)的相似程度较高，证明益生菌的食用添加对于小鼠肠道菌群失衡的调理 作用效果显著，具有治疗作用。
[0235] 表9小鼠粪便细菌微生物区系16S rDNA V6-V8区引物的DGGE分析
[0237] 注：H'A, Shannon Wiener index, H'maxB, maximum Shannon Wiener index. E = H,A/H'maxB· Results are shown as M+SD. Compared to control group, aP<0. 01, bP<0. 05. Compared to antibiotics group, CP<0. 05.
[0238] 4、小鼠结肠 HE染色分析
[0239] HE染色表明正常组小鼠结肠黏膜完整，上皮细胞刷状缘清晰可见，具有正常的粘 膜下血管，腺体结构排列紧凑规则，无充血，无水肿现象，见图6-A。模型组结肠粘膜上皮细 胞广泛缺失，腺体大多数不完整，结肠柱状上皮轻度水肿，部分脱落于肠腔，可见隐窝脱落、 炎症细胞广泛浸润，呈典型炎症改变，见图6-B。益生菌治疗组与模型组比较，小鼠结肠上皮 水肿得到缓解，但是与对照组比较肠绒毛仍有部分的脱落，见图6-C。
[0240] 初步的探讨了混合益生菌对小鼠肠道菌群失调的调节作用。
[0241] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一株具有氨苄青霉素抗性的长双歧杆菌，其特征在于：名称为长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum)HB25,于2014年5月23日保藏于中国武汉市武汉大学的中国 典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M 2014235。2. -株具有氨苄青霉素抗性的嗜酸乳杆菌，其特征在于：名称为嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus) HL9,于2014年5月23日保藏于中国武汉市武汉大学的中 国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :M 2014234。3. -种用于治疗肠道疾病的制剂，其特征在于：包括权利要求1所述的长双歧杆菌 HB25和/或权利要求2所述的嗜酸乳杆菌HL9。4. 根据权利要求3所述的制剂，其特征在于：还包括动物双歧杆菌 BB-12(BifidobacteriumanimalisBB-12)、鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillusrhamnosus GG)、嗜热链球菌ATCC14485(StreptococcusthermophiIusATCC14485)或植物乳杆菌 ATCC8014(LactobacillusplantarumATCC8014)中的一种或一种以上。5. 根据权利要求3所述的制剂，其特征在于：长双歧杆菌HB25和嗜酸乳杆菌HL9按照 体积比1 : (0. 2~5)的比例进行混合。6. 根据权利要求3所述的制剂，其特征在于：所述的长双歧杆菌HB25或嗜酸乳杆菌 HL9 的浓度为IO7~10 12CFU/mL。7. 权利要求1所述的长双歧杆菌HB25或权利要求2所述的嗜酸乳杆菌HL9在制备治 疗肠道疾病的药物中的应用。8. 权利要求1所述的长双歧杆菌HB25或权利要求2所述的嗜酸乳杆菌HL9在构建肠 道菌群失调的腹泻动物模型中的应用。9. 根据权利要求3~6任一项所述的制剂在制备治疗肠道疾病的药物中的应用。10. 根据权利要求3~6任一项所述的制剂在构建肠道菌群失调的腹泻动物模型中的 应用。
【专利摘要】本发明公开具有氨苄青霉素抗性的乳酸菌及其制剂的制备与应用。本发明用人体粪便在抗生素压力下分离得到2株具有耐药性的乳酸菌，并进行了抗生素敏感性实验，以及检测是否存在质粒DNA；采用PCR扩增分析菌株的耐药基因定位情况，探索了乳酸菌耐抗生素的分子机制，并对筛选具有抗性基因乳酸菌进行安全性评价；对筛选的抗性菌株进行验证是否对肠道失调具有调节作用，采用“抗生素型肠道菌群失衡模型”，旨在为临床上使用抗生素引起的腹泻、菌群失调等疾病提供潜在的治疗方法。本发明获得的菌株，当临床再次使用抗生素时，肠道益生菌能够在抗生素压力下存活，而普通的益生菌则不能存活，因此，可为临床上抗生素引起的腹泻提供治疗方法。CCTCC NO：M 201423520140523
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/23, C12R1/01, A61P1/00, A61K35/745, A61K35/747
【公开号】CN105176857
【申请号】
【发明人】孙晗笑, 田鹏, 杨妍, 利时雨, 丁清, 韦丕金, 刘照兵, 黄俊丽
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年6月12日