型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2014年5月 23 日，保藏号：CCTCC NO :M 2014235 ;
[0086] 比对结果显示，该菌株的16S rDNA序列与其它多株嗜酸乳杆菌的16S rDNA序 列有98 %的相似性，初步判断为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus)，将其命名为 Lactobacillus acidophilus HL9〇
[0087] 该嗜酸乳杆菌，名称为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus)HL9,保藏单位： 中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2014年5 月 23 日，保藏号：CCTCC NO :M 2014234 ;
[0088] Bifidobacterium longum HB25 菌株的 16S rDNA 序列：（共 1476bp)如 SEQ ID No. 3所示。
[0089] Lactobacillus acidophilus HL9 菌株的 16S rDNA 序列：（共 1488bp)如 SEQ ID No. 4所示。
[0090] 实施例2益生菌的生物学活性评价
[0091] 待测菌为实施例 1 获得的 Bif idobacterium longum HB25 和 Lactobacillus acidophilus HL9,对照菌株为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus GG，简称 LGG， ATCC 53103)，分别取实验室冻存于-80°C的菌株，于37°C水浴中融化，在生物安全柜中分 别取各菌IOOyL于IOOmL的乳酸菌MRS增菌肉汤培养基中进行活化复苏。于37°C气浴 摇床上200rpm摇菌12h，菌液进行4000rpm离心15min，离心后去上清液，菌体沉淀用无菌 生理盐水洗涤3次，然后将菌体沉淀转移至与标准比浊液离心管相同的试管中，使用无菌 生理盐水稀释至需要比标准比浊液的浓度（细菌浊度和10个小麦浊度标准管当量），即 3X 10sCFU/mL，即得HB25菌悬液、HL9菌悬液和LGG菌悬液。
[0092] 指不菌为 Escherichia coli ATCC11105、Clostridium difficile NY-5、 Staphylococcus aureus NT-12 ;分别取冻存于_80°C的菌株，于37°C水浴中融化，在生物安 全柜中分别取各菌100 μ L于IOOmL的LB液体培养基中进行活化复苏。于37°C气浴摇床 上200rpm摇菌12h，取少量菌液用LB液体培养基10倍倍比稀释，确定OD 600值为0. 08~ 0. 12的稀释度，菌液比浊管麦斯威尔浊度约0. 5,约含3 X 10sCFU/mL，即得ATCCl 1105菌悬 液、NY-5菌悬液和NT-12菌悬液。
[0093] 1、抑菌活性测定
[0094] 移液器取 200 μ L 指不菌（指不菌为 Escherichia coli ATCC11105、Clostridium difficile NY-5、Staphylococcus aureus NT-12 ;其中，大肠杆菌 Escherichia coli ATCC11105 购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC)， 梭状芽抱杆菌 Clostridium difficile NY-5 和金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus NT-12购自南阳奇伟微生态基因科技开发有限公司）菌悬液含菌数为3.0X 10sCFU/mL，分 别加入到温度为50°C左右的指示菌生长琼脂培养基（指示菌生长琼脂培养基：A、普通细菌 培养的营养琼脂培养基（用于大肠杆菌增菌）=NaCl 5. 0g，胰蛋白胨20. 0g，牛肉膏蛋白胨 3. 0g，琼脂15. 0g，补充蒸馏水至lOOOmL，用pH计监控并调节培养基pH7. 0~7. 2,121°C湿 热灭菌15min灭菌，备用；B、胰蛋白胨大豆（TSA)琼脂培养基（金黄色葡萄球菌的增菌和梭 状芽孢杆菌增菌）：胰蛋白胨17. Og/L，植物蛋白胨3. Og/L，氯化钠5. Og/L，K2HP042. 5g/L， 葡萄糖2. 5g/L，琼脂15. 0g/L，pH计调pH至7. 0~7. 2,121°C湿热灭菌15min灭菌，备用） 中，迅速混合均匀，倒平板。待平板冷凝后用无菌镊子取出已灭菌的直径为6_的圆形滤 纸片，加100 y L待测囷的囷悬液浸湿滤纸片，待完全吸收后，将滤纸片贴放在含有指不囷 的指示菌生长琼脂培养基平板中央，迅速转入恒温培养箱37°C厌氧培养24h !Clostridium difficile NY-5为厌氧指示菌，则厌氧培养48h后，测定抑菌圈直径，并设重复，取抑菌圈 直径的平均值。
[0095] 2、耐低pH菌株的筛选
[0096] 取40mL乳酸菌MRS增菌肉汤培养基，用4mol/L的HCl将各份培养基的pH调节为 3. 0、3. 5、4. 0。将制备好的待测菌菌悬液按体积百分比2%接种量，分别接种至pH3. 0、3. 5 和4. 0的乳酸菌MRS增菌肉汤培养基中，37°C厌氧培养24h，并在620nm处测定细菌的OD 值。
[0097] 3、耐胆盐菌株的筛选
[0098] 所有冷冻保藏的实验菌株均连续转接3次，每次37°C、200rpm厌氧培养24h，方可 用于实验。将制备好的待测菌菌悬液，按体积百分比2%分别接入含体积百分比0. 15%， 0. 3%牛胆汁的乳酸菌MRS增菌肉汤培养基中，每个浓度做3个平行；37°C、200rpm厌氧连 续培养24h，并测定A620nm处的细菌吸光度。
[0099] 4、粘附性试验
[0100] 将实施例1获得的2株菌株，用于进行粘附性实验，其中对照菌株为鼠李糖乳杆 菌（Lactobacillus rhamnosus GG，简称 LGG，ATCC 53103)(鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus GG，简称LGG，ATCC 53103购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC))。
[0101] (I)细胞培养物制备
[0102] Caco-2和Hela 229细胞（Caco-2和Hela 229细胞系购自汉恒生物科技（上海） 有限公司），分别按常规传代培养于含质量百分数10%小牛血清的DMEM细胞培养液（DMEM 细胞培养液：将50g DMEM粉末溶于950mL去离子水，加入3. 7g碳酸氢钠，并用氢氧化钠溶 液调pH至7. 2,去离子水定容至lOOOmL，0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，并分装，4°C冰箱保存 备用）中，37°C培养于CO2培养箱中每48h换培养液一次，长成单层后传代接种于有盖玻片 的96孔组织培养板上，5% (v/v)的二氧化碳37°C孵育48小时后，进行粘附性实验。
[0103] (2)细菌粘附性试验
[0104] ①试验前将菌株活化成斜面备用；
[0105] ②在 37°C和 5% (v/v)C02条件下，培养 Caco-2 和 Hela 229 细胞；
[0106] ③取制备好的待测菌菌悬液和对照菌株（Lactobacillus rhamnosus GG，简 称LGG，ATCC 53103)菌悬液分别加入到培养好的Caco-2和Hela 229细胞中，37°C培养 60min ；
[0107] ④用PBS缓冲液（0.1 M pH7. 2的PBS缓冲液）清除没有附着在细胞上的乳酸菌， 洗涤3~4次；
[0108] ⑤然后用胰酶-EDTA消化液（胰酶-EDTA消化液：用PBS液溶解胰酶和EDTA，配 制胰酶使其最终浓度为〇. 25 %，EDTA最终浓度为0. 025 %。并经过0. 22 μ m无菌微孔滤膜 过滤除菌，分装于灭菌的盐水瓶中，-20°C冰箱保存备用）消化单层细胞，细菌涂布于乳酸 菌MRS增菌肉汤琼脂培养基（在乳酸菌MRS增菌肉汤培养基中加入15g/L的琼脂）平板上 37°C厌氧培养，并细菌计数。每组实验平行重复3次。
[0109] (3)细菌粘附率计算
[0110] Adhesion rate% = CFU bacteria adhered/CFU bacteria added(粘附率％ =细 菌附着数/细菌总数）结果进行统计学处理。
[0111] 5、药敏试验
[0112] (1)材料一药敏纸片：11种抗菌药物药敏纸片：利福平（Rf，5 μ g)，氨苄西林（AM， 10以8)，头孢西丁奸，3(^8)，头孢噻肟（(^，3(^8)，四环素0^3(^8)，氯霉素（〇1， 3〇48)，环丙沙星（(^，5 4 8)，阿米卡星仏1(，3(^8)，庆大霉素（61，1(^8)，甲氧苄氨嘧啶 (TMP，5 μ g)，万古霉素（VA，30 μ g)，均购自广州市宜康生物科技有限公司（Oxoid)。
[0113] (2)步骤：根据美国临床实验室标准化协会颁布的KB法进行药敏试验（CLSI， 2009)。首先用无菌镊子分别夹取含有不同抗生素的药敏纸片，分别贴在已接种待测菌的各 平板（200 μ L待测菌菌悬液含菌数为3. 0 X 108CFU/mL，分别加入到温度为50°C左右的乳酸 菌MRS增菌肉汤琼脂培养基）中，迅速混合均匀，倒平板。每个平板贴大约5张药敏纸片， 各纸片间距离大致相等，并做好标记。在37°C厌氧过夜培养，观察平板抑菌情况，游标卡尺 测定抑菌圈的大小并记录。
[0114] 6、实验结果：
[0115] (1)抑菌活性的试验结果，见表3
[0116] 表 3 B. Iongum HB25 和 L. acidophilus HL9 抑菌活性的试验结果
[0118] (2)耐低pH耐胆盐实验结果，见表4
[0119] 表 4 B. Iongum HB25 和 L. acidophilus HL9 耐低 pH 耐胆盐试验结果
[0120] CN 105176857 A 说明书 13/21 页
[0121] (3)粘附性试验
[0122] 对2株待测益生菌作用于Caco-2细胞系和阴道子宫颈癌细胞HeLa 229细胞系 的粘附能力进行了评估，其结果见图1所示。对于Caco-2细胞系（见图1-A)，与对照组 L.rhamnosus GG(46. 23%)相比，B. Iongum HB25 (53.41% )，L. acidophilus HL9 (44. 17%) 的粘附效率比较适中；对于HeLa 229细胞系（见图1-Β)，Β· longum HB25和L acidophilus HL9对于Hela细胞的粘附效率均低于LGG(35. 79% )，这说明益生菌的粘附具有宿主特异 性。不同的益生菌菌株之间的粘附力有明显的差异，而且同种益生菌菌株对于不同细胞的 粘附能力也各不相同。
[0123] (4)药敏试验，结果见表5所示；
[0124] 表 5 B. Iongum HB25 和 L. acidophilus HL9 的药敏试验结果
[0126] 注：S-敏感；R-耐药；I-中度耐药。
[0127] 实施例3
[0128] 1、菌株质粒的分析
[0129] 根据万谦的方法（万谦，曹健，吴兴泉等.乳酸菌天然质粒提取方法的优化[J]. 中国生物工程杂志，2010, 30(2) :94-99.)进行质粒的提取，取培养过夜的待测菌菌株5~ IOmL离心后弃上清，用250 μ L溶液Pl (加入溶菌酶，至终浓度20mg/mL)重悬，37°C水浴 30min ;加入250 μ L溶液P2迅速混匀后加入350 μ L溶液P3,混匀，12000rpm离心10min ; 取上清加入离心柱中，9000rpm离心lmin，弃去离心管中液体；用500 μ LWash Buffer洗 涤离心柱两次，将离心柱放入新的EP管中12000rpm离心2min，然后加入50 μ L Elu