tion Buffer (预先60°C预热），放置2min后离心，备用。用I %琼脂糖凝胶电泳检测，结果如表 6所示。
[0130] 所述的溶液 Pl: 50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris · HCl (pH8. 0) 10mmol/L EDTA(pH8. 0);须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触 震荡，可使沉淀迅速分散。
[0131] 所述的溶液P2 :0· 2mol/L NaOH(临用前用lOmol/L贮存液现用现稀释），1 % (w/ w) SDS盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶 液II接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。
[0132] 所述的溶液P3 :5mol/L乙酸钾，60mL冰乙酸，11. 5mL水，28. 5mL，所配成的溶液对 钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液III在粘稠的 细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5分钟。
[0133] 表 6 待测菌株 B. Iongum HB25 和 L. acidophilus HL9 没有质粒
[0135] 2、耐药基因的鉴定
[0136] 耐药基因 PCR和耐药基因定位
[0137] 以待测菌的基因组DNA为模板；
[0138] 氨苄引物：上游：引物 F :5' -GCAACTTTATCCGCCTCCAT-3' ；
[0139] 下游：引物 R :5, -CATTTCCGTGTCGCCCTTAT-3' ；
[0140] PCR反应体系：
[0142] PCR 反应条件：94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，68°C退火 30s，72°C延伸 6min，退 火温度每个循环降低l°c，12个循环，直至57°C ;然后94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延 伸6min，进行30个循环；最后72°C延伸lOmin。
[0143] PCR反应结束以后，根据Marker分子量比较产物的大小，与已知片段大小进行比 照，可确定菌株中是否含有相应抗性基因。
[0144] 从图 2 中可以看出我们从 Bifidobacterium longum HB25 和 Lactobacillus acidophilus HL9基因组DNA中扩增得到amp耐药基因。
[0145] 3、耐药基因定位的鉴定
[0146] (1)探针制备：
[0147] 经过耐药性分析，得到具有染色体耐药性的2株菌长双歧杆菌Bifidobacterium longum HB25 和嗜酸乳杆菌 Lactobacillus acidophilus HL9,用 NuSieve-低恪点琼脂糖 纯化HB25、HL9的氨苄抗性基因 amp PCR产物两次，并地高辛标记探针（DIG系统）。
[0148] (2)模板制备：
[0149] 长双歧杆菌 Bifidobacterium longum HB25 和嗜酸乳杆菌 Lactobacillus acidophilus HL9菌株的基因组DNA(参照TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒的说 明书）用HindIII酶酶切消化。取10 μ L待测DNA，于1 %的琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶 用IiB染料染色，记录结果，结果如图3-Α所不。
[0150] (3)杂交用胶的制备和DNA转膜：
[0151] Α、将电泳结束后的凝胶，小心放入30mL 0. 25mol/L HCl溶液中完全浸入15min。
[0152] B、用蒸馏水短暂洗凝胶2次。
[0153] C、将清洗后的凝胶放入含有30mL的变性溶液（1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH) 中使凝胶变性30min。
[0154] D、将变性后的凝胶放入含有30mL中和液溶液（lmol/L Tris ·Η(：1，ρΗ8. 0,1. 5mol/ L NaCl)中使其中和15min。
[0155] 准备DNA从凝胶向膜转移的平台。切割与待转移胶大小相同的1张待用尼龙膜和 3张厚滤纸并在尼龙膜一角做一标记。另1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度长度约18cm足以 达到转移液盒子的底部。准备10 X SSC转移液（称取87. 66g NaCl和44. 12g柠檬酸三钠， 分别溶解，一起定容至1000 mL)。将待用尼龙膜放入蒸馏水中浸湿后，再浸入10 X SSC转移 液中。
[0156] (4) DIG 系统杂交：
[0157] 加入适量的探针到已预热的杂交液中混合均匀，根据的标准程序进行，在42°C下 进行严格的杂交、过夜，漂洗5min在2XSSC溶液中，然后使用2XSSC/0. 1% SDS在42°C 条件下进行IOmin洗膜；而后用I X SSC/0. 1 % SDS在42°C条件下进行IOmin洗膜；再次用 0· 5XSSC/0. 1% SDS在42°C条件下进行IOmin洗膜；结束后尼龙膜用0· 2XSSC/0. 1% SDS 在56°C洗膜IOmin ;转入0.1 X SSC/0. 1 % SDS在56°C洗膜lOmin。在尼龙膜的清洗过程中 不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。在暗房中取出X光片在显影液中进 行显影3~5min，用水冲洗去除显影液置于定影液中定影5~10min，取出X光片冲洗干净， 晾干。
[0158] 所述的显影液：温水（52°C )750mL、米吐尔3g、无水亚硫酸钠45g、对苯二酚12g、 无水碳酸钠67. 5g、溴化钾19g，水加至1000 mL ;
[0159] 所述的定影液：水750mL、硫代硫酸钠240g、无水亚硫酸钠15g、28% (w/w)醋酸 48mL、硼酸7. 5g、钾矾15g、水加至1000mL。
[0160] 结果如图3-B所示，通过杂交试验证明了在B. longum HB25基因组DNA大约6. 6~ 9. 4kb处有amp基因编码序列，同样在L. acidophilus HL9基因组DNA大约2. 3~4. 4kb处 有amp基因编码序列。而在氨苄敏感性LGG菌株基因组DNA里面没有检测得到amp基因， 证明试验方案有效。
[0161] 实施例4
[0162] 益生菌对肠道菌群的调节作用的过程如图7所示，A)肠道病原菌，有益菌和宿主 维持微生物的动态平衡；B)抗生素处理破坏肠道平衡，使肠道定植抵抗丢失，容易受到病 原菌的感染；C)肠道益生菌①通过分泌产生pH、细菌素拮抗病原菌，②通过竞争性拮抗病 原菌上皮细胞粘附位点抑制病原菌生长，③通过刺激机体免疫细胞T、B细胞，提高机体免 疫应答。
[0163] -、材料
[0164] 1、主要试剂
[0165] 氨节西林（Ampicillin)，克林霉素（clindamycin)和链霉素（streptomyci)，购自 上海新先锋药业有限公司（Oxoid)。
[0166] (1)培养基
[0167] 脑心浸液（Brain heart infusion，BHI)培养基：用于肠道厌氧总菌的分离，精 确称取C6H12O6 2. Og，NaCl 5. Og，BHI营养物27. 5g，磷酸二氢钠2. 5g，琼脂15. Og，加水至 lOOOmL，加入琼脂前调pH为7. 4±0. 2,115°C湿热灭菌15min。
[0168] BSM培养基：用于双歧杆菌分离，精确称取琼脂15g，L-半胱氨酸0. 5g，莫匹罗星 50mg，加水至lOOOmL，调节pH5. 0，115°C湿热灭菌15min，培养基冷却50°C左右加入莫匹罗 星。
[0169] SCE培养基：用于肠球菌分离，叠氮钠0. 5g，NaCl 5g，牛肉膏蛋白胨10g，七叶苷 0. 8g，0. 4mL 0. 05%结晶紫，酵母提取物5g，K2HPO4 4g，柠檬酸铁铵0. 5g，KH2PO4 I. 5g，溶解 后加入15g琼脂，并加水至1000mL，pH计调节溶液pH至8. 0,115°C湿热灭菌15min。
[0170] EMB培养基：用于肠杆菌分离，EMB琼脂粉末45g，加水至lOOOmL，煮沸溶解，115°C 湿热灭菌15min。
[0171] (2)小鼠粪便稀释缓冲液：
[0172] L-半胱氨酸 0· 5g，ImL 吐温 80,酵母粉 0· 5g，NaCl 9g，KH2PO4 0· 21g，Na2HPO40. 72g，补充蒸馏水至1000mL，并调节溶液pH至6. 2~6. 6,118°C高压蒸汽灭菌15min。
[0173] (3)三联抗生素溶液：
[0174] 于无菌条件下，取灭菌双蒸水配制125mg/mL的三联抗生素灌胃用溶液，抗生素溶 液均现配现用。
[0175] (4) IOmL DGGE 加样缓冲液：
[0176] 精确量取0.251^2%溴酚蓝，0.251^2%二甲苯青，71^100%甘油以及2.511^ MilliQ 水。
[0177] ⑶5〇 X TAE电泳缓冲液：
[0178] 精确称取242g Tris碱加入少量双蒸水（DDW)溶解，加入57. ImL的冰HAc，再加入 IOOmL ρΗ8· 0 的(λ 5mol/L EDTA，补加 DDW 定容至 1000mL，4°C冰箱储存。
[0179] (6) 40 %丙烯酰胺/双丙烯酰胺：
[0180] 精确称取丙稀酰胺38. 93g，甲叉双丙稀酰胺I. 07g，添加 DDW至100mL，常温下溶解 后0. 45 μ m微孔滤膜过滤，4°C避光保存。
[0181] (7) 10 % 过硫酸铵（AP):
[0182] 精确称取0. 3g过硫酸胺，加入双蒸水3. OmL，使粉末溶解后使用0. 45 μ m无菌微孔 滤膜过滤除菌，4 °C冰箱储存。
[0183] (8)DGGE lording buffer ：
[0184] 量取2%溴酚蓝0.2511^，2%二甲苯蓝0.2511^，7.011^100%甘油，0服2.511^。
[0185] (9) 400mL银染溶液的配制：
[0186] 精确称取0. 8g硝酸银，50mL 8 X固定液以及350mL MilliQ水。其中8 X固定液 溶液为200mL乙醇，IOmL冰HAc以及40mL MilliQ水。
[0187] (10)0 %的变性储存液：
[0193] 2、主要仪器
[0194] 病理切片机一德国Leica RM2235 ;血球计数板一国产；DGGE变性梯度凝胶电泳 仪一美国Bio Rad。
[0195] 3、实验动物
[0196] 30只小鼠购自中山大学实验动物中心，合格证号：SCXK (粵2011-0029)，SPF级小 鼠 BALB/c体重18~22g/只，鼠龄大约在8weeks左右，饲养在SPF级动物实验室，温度维 持在18~20°C，湿度维持在50~60%，实验所自动排风，每天光照大约12小时，每日上午 更换食、水和消毒垫料1次，并且分笼饲养观察7天能正常进食和饮水者纳入实验用鼠。
[0197] 二、实验方法
[0198] 1、建模
[0199] SPF级BALB/c小鼠被分成2个大组，即对照组和抗生素处理组。对照组一直灌胃 无菌生理盐水5d ;抗生素处理组小鼠灌胃剂量相当于成人正常10倍剂量的125mg/mL，三 联抗生素溶液0. 2mL/次，每天2次，灌胃时间间隔为6h，连续灌胃5d。观察小鼠的生理活 动（毛发、进食、粪便等情况）。
[0200] 2、腹泻观察及程度评定标准
[0201] 造模及治疗期间，观察受试动物排便状况及粪便外观每天1次。抗生素溶液灌胃 后立即观察用药反应2~3分钟，以后每12小时观察记录1次，记录内容：小鼠活动表现和 粪便变化情况。腹泻症状等级评定标准如下：
[0202] III级：水样便，不成形，几乎无粪质，每天排泄次数超过40次。
[0203] I