11,7:30.
[0114] 实施例4、
[0115] 4. I光合色素含量测定：
[0116] 由于ylhl突变体表型与温度没有明显的相关性，因此我们在大田取样，分别测定 苗期，分蘖期和抽穗期叶片叶绿素含量，同时测定光合速率。分别取突变体和NIP叶片去掉 主脉，剪成Icm左右的片段，称取0. 2g浸泡于IOml 80%丙酮，26°C条件下暗培养48小时。 取溶液在紫外分光光度计（DU800, BECKMAN COULTER) 663nm、645nm和470nm三种波长下测 定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的光密度值。3次重复，然后根据Amon(1949)的方法计算 出各检测叶片中的叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)的含量，按照Wellburn(1994)计算 类胡萝卜素（Car)的含量，计算公式如下：
[0117] chi a = (12. 7 X OD663- 2. 69 X OD 645) X V/ff
[0118] chi b= (22. 9 X OD645- 4. 68 X OD 663) X V/ff
[0119]car= (1000XOD470 XV/ff- 3.27XChla- 104XChl b)/198
[0120] 其中：V为提取液体积（10ml)，W为叶片质量0. 2g，0D663、OD645及OD 47。为在分光光 度仪上读取的光密度值，单位:mg/g。
[0121] 用德国WALS公司产的GFS-3000型光合测定仪测定抽穗期突变体与野生型剑叶净 光合速率，每个单株测一个主分蘖，20次重复计算平均值，净光合速率单位umol.m 2. s 1C3
[0122] 结果显示，与野生型相比，突变体在苗期、分蘖期和成熟期叶绿素a、叶绿素b及类 胡萝卜素的含量均明显减少，其中苗期各个光合色素含量降低最为明显（图7A，7B，7C)。但 Chl a/b的比值在各个时期均明显增加（图7D)。突变体ylhl净光合速率较野生型NIP明 显降低（图7E)。由此推断，突变体的表型变化是由于叶绿素和类胡萝卜素缺失引起，而黄 绿叶晚抽穗的表型会影响水稻净光合速率。为了验证互补转基因苗在叶绿素含量、净光合 速率方面是否得到回复，我们也测定了相关数据，测定结果显示互补转基因苗在叶绿素a、 叶绿素b、类胡萝卜素的含量方面均已恢复至NIP的水平（图9A)，而叶绿素a/叶绿素b的 比值和净光合速率也与NIP基本一致（图9B)，这些结果说明将NIP的FDC2基因转入ylhl 突变体中，可完全回复突变体的突变表型。
[0123] 4.2.铁元素含量测定：
[0124] 以分蘖期新抽出的突变体和野生型水稻叶片为待测样品，样品前处理及上样 检测方法参考赵肖华等（2012)、许萍等（2011)，使用电感耦合等离子体原子发射光谱 (ICP-AES)法检测铁元素含量。测定结果显示突变体（ylhl)中铁元素含量明显低于野生型 NIP(图7F)，这说明FDC2基因突变后会引起水稻铁元素含量的减少，从而引起突变体叶片 颜色的改变。
[0125] [1]赵肖华，曹赵云，牟仁祥，许萍，陈铭学.液相色谱-串联质谱法测定蔬菜、 水果中5种阿维菌素类药物残留量[J].分析测试学报，2012, 10:1266-1271.
[0126] [2]许萍，陈铭学，牟仁祥，金冬梅，周蓉.ICP-MS混合模式测定植物性农产品 中的9种痕量元素[J].分析测试学报，2011，10:1138-1142.
[0127] 实施例5、
[0128] 叶绿体透射电镜的制备和观察：
[0129] (1)样品：取突变体苗期叶片和对照野生型苗期叶片，切成0. 5~lmm3左右的小 块；
[0130] (2)固定：将切好的样品块放入2ml离心管中，加入2. 5%的戊二醛溶液（PH = 7. 2)，在抽真空仪器中抽真空直到叶片完全下沉。0.1 M磷酸漂洗三次，每15min -次，然后 加入1 %锇酸固定2~3小时，直至样品变黑；
[0131] (3)脱水：先用50%、70%、和90%的乙醇溶液依次脱水，每个浓度处理20分钟， 再用乙醇和丙酮（1 :1)溶液处理20分钟，以上均在4度冰箱内进行，最后将样品用纯丙酮 室温处理20分钟；
[0132] (4)渗透：将样品在无水丙酮和包埋剂（3 :1)混合液中作用4小时，再在无水丙酮 和包埋剂（1 :1)混合液处理3小时，最后在纯的包埋剂中作用12小时；
[0133] (5)包埋：将上述步骤中的样品挑的包埋盒内，37°C过夜，45°C处理12小时最后 60°C处理24小时，获得包埋样品；
[0134] (6)切片、拍照：将包埋样品用超薄切片机切成60-70nm左右的超薄片，然后将切 片用柠檬酸铅溶液染色10分钟，再有醋酸铀溶液染色30分钟，双蒸水清洗三次后晾干，用 HitachiH-7650型透射电镜观察并且选择清晰地倍数拍照。
[0135] 结果显示野生型叶片的叶肉细胞中叶绿体数目较多，叶绿体结构完整，叶绿体中 基粒片层层次丰富，排列紧密。突变体叶片相比野生型虽然叶绿体数目的变化不大，但基粒 堆叠层数明显减少，而且排列没有野生型那么紧密、整齐，嗜锇颗粒明显增加（图8)。观察 结果表明基因突变造成了突变体中叶绿体结构发育缺陷。
[0136] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 水稻铁氧还蛋白编码基因0sFDC2编码的蛋白质，其特征在于：该蛋白质为SEQID No: 3所示的氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的水稻铁氧还蛋白编码基因0sFDC2编码的蛋白质，其特征在 于：所述氨基酸序列还包括在SEQIDNo:3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一 个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。3. 编码权利要求1或2所述蛋白质的基因，其特征在于：该基因具有SEQIDNo:1、SEQ IDNo:2所示的核苷酸序列。4. 根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述核苷酸序列还包括在SEQIDNo:1、 2所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基 因或衍生物。5. -种含有权利要求3或4所述基因的质粒。6. -种含有权利要求3或4所述基因的植物表达载体。7. -种宿主细胞，其特征在于：该宿主细胞含有权利要求3或4所述的基因序列。8. 根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于：该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞 或植物细胞。9. 如权利要求3或4所述基因的用途，其特征在于：用于构建转基因水稻，所述转基因 水稻的叶片颜色得以改良。10. -种改良水稻叶片颜色、影响水稻Fe含量及对Fe的耐受度、提高光合效率、调节水 稻抽穗期的方法，其特征在于：包括用具有SEQIDNo:1、2所示的核苷酸序列的基因转化 水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。
【专利摘要】本发明公开了一种本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻OsFDC2基因，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因编码产物研究对水稻叶绿体发育、Fe元素含量、抽穗时间及光合作用的影响，可用于解决杂交稻育种过程中杂种剔除、调节Fe元素含量、抽穗期及光合效率等。
【IPC分类】C12N5/10, C12N15/70, C07K14/415, C12N15/82, C12N15/74, A01H5/00, C12N15/29
【公开号】CN105175520
【申请号】
【发明人】朱丽, 钱前, 王小琦, 赵娟, 邱振楠, 康书静, 赫磊, 张森, 曾大力, 张光恒, 胡江, 郭龙彪, 董国军, 任德勇, 高振宇, 陈 光
【申请人】中国水稻研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月1日