水稻铁氧还蛋白编码基因OsFDC2及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克 隆水稻0sFDC2基因，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因 编码产物研究对水稻叶绿体发育、Fe元素含量、抽穗时间及光合作用的影响，可用于解决杂 交稻育种过程中杂种剔除、调节Fe元素含量、抽穗期及光合效率等。
【背景技术】
[0002] 铁硫蛋白（Ferredoxin，Fd)又名铁氧还蛋白，是一类具有重要生物功能的金属 酶，普遍存在于细菌、藻类、动物及高等植物。所有的Fd均包含被保守残基螯合的Fe-S原子 簇反应中心。高等植物的Fd可分为光合型Fd (主要存在于绿色部分）和非光合型Fd (主要 分布于非光合组织）。光合型Fd可将光激发出的电子从光合系统I (PSI)传递给位于光合 膜基质侧的水溶性Fd，在Fd :NADP+氧化还原酶（LFNR)的作用下，最终将电子传递给NADP + 生成还原态的NADPH以及ATP，被用于固定0)2的酶促暗反应和其他一系列依赖于光的代谢 过程和调节反应。目前已知许多质体酶都依赖于Fd提供电子，包括氮同化中的氮还原酶、 硫同化中的硫还原酶、氨基酸合成中的谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶、脂肪酸合成中的 脂肪酸去饱和酶以及氧化还原调节中的硫氧还蛋白还原酶等，与碳、氮的同化与固定，硫酸 盐和硝酸盐的还原，谷氨酸的合成等许多生理生化过程密切相关。光合作用为水稻的生长 提供了物质来源和能量来源，叶绿体是进行光合作用的重要场所，同时也是光合色素的载 体，广泛分布在叶片绿色组织细胞中。光合系统I是整合于叶绿体光合膜上的，由多个蛋白 亚基组成的蛋白复合物，现已证明，光合生物对光能的吸收、传递和转化都是在光合膜上通 过光合系统来完成的，因此从分子水平上揭示各种光合系统复合物的结构和功能及其相互 关系，不仅对于阐明光合作用光能转化机理具有重要理论意义，而且在通过提高光合效率， 培育高产新品种方面具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种与水稻叶色变异相关的蛋白质及其基因，以 及由此获得的转基因植物细胞，和利用所述基因对水稻叶片颜色进行改造的方法。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻铁氧还蛋白编码基因0sFDC2(水稻 光合电子传递调控基因0sFDC2)编码的蛋白质，该蛋白质为SEQIDNo:3所示的氨基酸序 列。
[0005]作为本发明的水稻铁氧还蛋白编码基因0sFDC2编码的蛋白质的改进，氨基酸序 列还包括在SEQ ID No :3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或 其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
[0006]本发明还同时提供了一种编码上述蛋白质的基因，该基因具有SEQ ID No :1、SEQ ID No :2所示的核苷酸序列。
[0007]备注说明：SEQ ID NO :1为cDNA全长，SEQ ID NO :2为gDNA全长。
[0008] 作为本发明的基因的改进：所述核苷酸序列还包括在SEQ ID No :1、2所示的核苷 酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。
[0009] 本发明还同时提供了含有上述基因的质粒。
[0010] 本发明还同时提供了含有上述基因的植物表达载体。
[0011] 本发明还同时提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述基因序列。细胞例如为 大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
[0012] 本发明还同时提供了上述基因的用途，其特征在于：用于构建转基因水稻，所述转 基因水稻的叶片颜色得以改良（从而使该转基因水稻能提高光合效率）。
[0013] 本发明还同时提供了一种改良水稻叶片颜色、影响水稻Fe含量及对Fe的耐受度、 提高光合效率、调节水稻抽穗期的方法：包括用具有SEQ ID No :1、2所示的核苷酸序列的 基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。
[0014] 进一步具体说明：本发明的目的是提供一种从水稻黄绿叶晚抽穗突变体（yellow leaf and late heading l，ylhl)中克隆的新基因 0sFDC2,具有如 SEQ ID No:l 和 SEQ ID No :2所示的DNA序列，也包括与SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示的DNA序列至少有70% 同源性的基因序列。本发明中的SEQ ID No :3所示的蛋白质属于铁硫蛋白，其中进行一个 或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQ ID No :1和SEQ ID No: 2中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相 同功能的序列也能达到本发明的目的。
[0015] 本发明的另一个目的是提供一种用0sFDC2基因进行高效的植物转化的方法，具 体地说，本发明提供了具有SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示的序列的基因或基因部分片 段的载体，其中，如图4所示的pCAMBIA1300-0sFDC2,该载体可以表达有上述核苷酸序列编 码的多肽或其同源类似物。
[0016] 本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞影响水稻叶色的方法。具体 地是利用植物表达载体转化植物细胞以影响水稻叶色的方法。
[0017] 实现本发明的具体技术步骤如下：
[0018] -、水稻黄绿叶晚抽穗突变体ylhl的分离和遗传分析：
[0019] 本发明的水稻黄绿叶晚抽穗突变体ylhl来自日本晴EMS (Ethyl Methyl Sulfonate)诱变产生的突变（图1)。ylhl通过与野生型水稻的反交实验，证明该突变体受 隐性单基因控制。
[0020] 二、图位克隆控制水稻黄绿叶晚抽穗性状的OsYLHl基因：
[0021] I)、OsYLHl基因的初步定位：
[0022] 为了分离OsYLHl基因，本发明首先组建了一个定位群体，由ylhl与籼稻品种 TNl(Indica)杂交组配成匕定位群体，再通过图位克隆的方法，利用STS、SSR等分子标记对 0sFDC2位点进行初步定位，将其初步定位在第3染色体的长臂端，并介于ZJ8-2和RM1350 两标记之间，见图2。
[0023] 2)、OsYLHl基因的精细定位与预测：
[0024] 通过对ZJ8-2和RMl350两个标记之间的BAC序列分析，发展新的SSR、STS标记将 0sFDC2精确定位于BAC 0SJNBb0072E24上ZJ8-43与ZJ8-28标记之间38. 2-kb范围之内 (图3)，通过分析此区段开放阅读框（ORF)推测候选基因。
[0025] 3)、OsYLHl基因的鉴定和功能分析：
[0026] 为了验证候选基因功能，构建了如图4所示的互补载体，通过转基因技术，将互补 载体转入到突变体ylhl中，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻 (图5)，证明本发明正确克隆了 OsYLHl基因，氨基酸序列分析表明0sFDC2编码铁硫蛋白。 此外，由于该基因编码蛋白对叶绿体的发育和光合效率有影响，我们还构建了如图6所示 亚细胞定位载体，通过水稻原生质体转化技术证明0sFDC2蛋白在细胞中定位于叶绿体。
[0027] 本发明利用水稻黄绿叶晚抽穗突变体ylhl，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆 到了 0sFDC2基因，该基因编码铁硫蛋白，在水稻中影响叶绿体的发育及光合效率，其它植 物的同源基因均未被克隆，相关功能未知。通过对0sFDC2基因的功能解读，不仅丰富了叶 绿体发育及光合效率的分子调控机制，对于阐明光合作用光能转化机理也具有重要理论意 义。
[0028] 叶绿体是植物进行光合作用的重要场所，广泛分布在叶片绿色组织细胞中。黄绿 叶突变典型特征是叶绿体发育异常，大部分黄绿叶突变体缺乏叶绿素，光合效率下降，植物 黄绿叶突变产生机制非常复杂，涉及光合电子传递、核-质基因组互作、质体基因及基因与 环境的互作等过程，目前