水稻铁氧还蛋白编码基因OsFDC2及其用图_2

文档序号:8958018阅读:来源:国知局
对黄绿叶的分子机理研究还仅停留在叶绿素代谢的层面,更为复 杂的调控模式还不清楚。本发明获得的黄绿叶晚抽穗突变体,是众多黄绿叶突变体中较为 特殊的一类,其相关基因编码蛋白主要是通过改变光合电子传递,进而对叶绿体的发育和 光合效率产生影响。通过图位克隆技术本发明首次在水稻中克隆了相关基因0sFDC2,该基 因编码铁硫蛋白,在水稻中影响叶绿体的发育及光合效率,其它植物的同源基因均未被克 隆。通过对0sFDC2基因的功能解读,将为深入研究叶绿体发育机制,阐明植物光合系统作 用的分子机理,进而为水稻高光合育种奠定基础。
[0029] 综上所述,本发明利用水稻黄绿叶晚抽穗突变体ylhl,通过图位克隆技术首次在 水稻中克隆到了 0sFDC2基因,该基因编码铁硫蛋白,在水稻中影响叶绿体的发育,降低光 合效率,其它物种的同源基因均未被克隆,相关功能未知。通过对0sFDC2基因的功能解读, 进一步明确了 〇sFDC2对水稻叶绿体发育及光合效率的影响,同时为深入揭示光合作用光 能转化机理奠定基础。
【附图说明】
[0030] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0031] 图1为水稻黄绿叶晚抽穗突变体ylhl与野生型苗期、分蘖期表型及叶片特写;
[0032] A为苗期野生型和突变体表型及对应叶片特写图;
[0033] B为分蘖期野生型和突变体表型及对应叶片特写图。
[0034] 图2为OsYLHl基因在水稻第3染色体上的初步定位图。
[0035] 图3为OsYLHl基因的精细定位及突变位点示意图;
[0036] (A)为OsYLHl基因的精细定位图;
[0037] (B)为OsYLHl基因定位区间序列分析及突变位点分析图;
[0038] (C)为OsYLHl基因在野生型和突变体中突变位点序列分析图;
[0039] (D)为OsYLHl基因在野生型和突变体中突变位点测序比对图。
[0040] 图 4 为互补载体 pCAMBIA1300-0sFDC2 图谱。
[0041 ] 图5为功能互补实验TO转基因水稻植株表型及测序验证;
[0042] (A)为互补载体转化突变体ylhl的转基因株表型图,从左至右分别为野生型,突 变体及转化互补载体的突变体转基因株;
[0043] (B)为互补载体转化突变体ylhl的转基因株叶片特写图,从左至右分别为野生 型,突变体及转化互补载体的突变体转基因株;
[0044] (C)为转化互补载体的突变体ylhl转基因株OsYLHl基因测序分析结果,箭头所指 为突变位点。
[0045] 图6为0sFDC2亚细胞定位载体的构建及原生质体转化结果;
[0046] (A)为 0sFDC2: : GFP 融合载体图;
[0047] (B)为0sFDC2在细胞中的亚细胞定位图;Brightfield为明场观察结果;GFP为绿 色荧光观察结果;Chlorophyll为叶绿体自发荧光观察;Merged为绿色荧光与叶绿体自发 荧光合并后的观察结果。
[0048] 图7为突变体ylhl与对照日本晴光合色素含量、净光合速率及铁含量测定;
[0049] A为对照日本晴与突变体ylhl叶绿素a含量测定结果;
[0050] B为对照日本晴与突变体ylhl叶绿素b含量测定结果;
[0051] C为对照日本晴与突变体ylhl类胡萝卜素含量测定结果;
[0052] D对照日本晴与突变体ylhl叶绿素a/b的比值;
[0053] E为对照日本晴与突变体ylhl净光合速率含量测定结果;
[0054] F为对照日本晴与突变体ylhl铁含量测定结果。
[0055] 图8为透射电镜分析突变体ylhl与对照日本晴叶绿体形态的变化;
[0056] 从右至左分别为放大6000倍,25000倍及50000倍的叶绿体显微结构,白色箭头所 指为逐步放大区域。
[0057] 图9为互补转基因植株叶绿素含量及光合效率测定;
[0058] A :互补转基因植株叶绿素含量测定及叶绿素a/b值;B:互补转基因植株净光合速 率测定。
【具体实施方式】
[0059] 实施例1 :
[0060] 1、水稻材料:
[0061] 水稻(Oryza sativa L.)突变体ylhl,原始野生材料为粳稻品种"日本晴(NIP) "。
[0062] 水稻黄绿叶晚抽穗突变体ylhl来自日本晴EMS(Ethyl Methyl Sulfonate)诱变 产生的突变(如图1所示),该突变体是在中国浙江省境内获得。与对照品种农艺性状比较 如下:
[0063]
[0064] **代表突变体与野生型间存在极显著差异,P〈0. 01
[0065] 该诱变方法具体为:用I. 5% EMS浸泡水稻种子8h,清水冲洗后正常发芽;在Ml代 选择黄绿叶晚抽穗表型的突变体ylhl,经多代稳定遗传后用于群体构建和基因定位。
[0066] ylhl通过与野生型品种(即,籼稻品种TN1)的反交实验,证明该突变体受隐性单 基因控制。实验的结果为:在M2代群体中随机选择65个单株进行遗传分析,51株为野生 型表型,14株为突变型表型,卡平方检测结果(X 2=0. 37〈X20.0 5=3. 84),分离比符合 3 :1,说明该突变表型由单隐性核基因控制。以籼稻品种TNl为父本,ylhl为母本进行反交 所得的Fl代植株全部表现为正常表型,F2代种子播种四周后,随机选350个单株其中268 株表现为野生型表型,82株表现为突变型表型。卡平方检测结果(x2=〇.45〈X20.0 5 = 3. 84),正常植株表型和突变体植株表型分离比符合3 :1 ;进一步证明该突变表型受隐性单 隐性核基因控制。
[0067] 2、分析和定位群体:
[0068] 纯合的ylhl突变体和野生型品种籼稻品种TNl进行杂交,F1代自交,得到F 2群体。 并从中选出5413株ylhl突变个体作为定位群体。在三叶期期每株取1克左右的嫩叶,用 来提取总DNA。
[0069] 3、SSR和STS标记定位0sFDC2基因
[0070] 采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组 DNA。取大约0. 2g水稻叶片,经液氮冷冻,在直径5cm的小研钵中磨成粉状,转移到I. 5ml 离心管里提取DNA,获得的DNA沉淀溶解于150 y 1超纯水中。每一个PCR反应用2 y I DNA 样品。
[0071] 0sFDC2基因的初步定位:在ylhl与TNl组合的F2群体中选取30个隐性个体, 根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱,选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引 物,根据已知的反应条件进行PCR扩增,经5%琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色, 检测PCR产物的多态性,将0sFDC2初步定位在第3号染色体长臂端ZJ8-2和RM1350两STS 标记之间(如图2所示)。
[0072] 备注说明:上述30个隐性个体是包含在5413株突变体中的,本发明先用30株做 初定位,然后放大群体至5413用于精细定位和基因克隆。
[0073] 0sFDC2基因的精细定位:选取ylhl与TNl组合的?2群体中共5413株隐性个体, 在初定位的基础上进一步设计SSR和STS标记,最终将0sFDC2精确定位于精确定位于BAC 号为0SJNBb0072E24上38. 2-kb范围之内(图3A),两边的分子标记为ZJ8-43与ZJ8-28引 物序列为:
[0076] 备注:引物序列见表1。
[0077] 表I、0sFDC2基因的定位标记序列
[0078]
[0079] 4、基因预测和比较分析:
[0080] 根据精细定位的结果,在38. 2_kb范围内根据RiceAutomatedAnnotation System(http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp)的预测,发现在
当前第2页1 2 3 4 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1