Mo Wang，Ding Tang et al. OsSPOll-1 is essential for both homologous chromosome pairing and crossover formation in rice. Chromosoma. 2010 (119) :625-636. "一文，公众可从中国科学院遗传与 发育生物学研究所获得。
[0093] 将DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3和经过Pst I和Sal I酶切的pCaml30X载 体骨架中，得到重组载体。
[0094] 经过测序，该重组载体为将序列表中序列3替换pCaml30X载体骨架Pst I和Sal I酶切位点间的DNA片段得到的重组载体，其中序列3第1-225位为DNA片段1、第433-656 位为DNA片段2、第226-432位为DNA片段3。该重组载体命名为pSRL2RNAi，即为RNAi干 扰载体。
[0095] pCaml30X载体为将组成型CaMV35S启动子片段（序列4)插入pCAMBIA1300的Pst I和Hind III酶切位点，且将277bp的NOS终止子片段（序列5)插入pCAMBIA1300的EcoR I和Sac I酶切位点，得到的载体；具体构建方法如下：
[0096] 用引物对 35S-F : (5' -AAGCTTCCCAGAirAGCCTTITCAAT-3'）和 35S-R : (5' -CTGCAG TCCCCCGTGITCTCTCCAA-3'）PCR 扩增质粒 pBI121(DingGuo，MCV032)得到约 855bp 的组成型 CaMV35S启动子片段（序列4);
[0097] 将该片段用PstI和HindIII双酶切，与经过同样酶切的载体 PCAMBIA1300 (DingGuo,MCV033)连接，得到中间载体pCaml30XM;
[0098] 用 EcoR I 和 Sac I 双酶切质粒 pBI121 (DingGuo, MCV032)，回收 277bp 的 NOS 终止 子片段（序列5)，将277bp的NOS终止子片段与经过EcoR I和Sac I双酶切的中间载体 pCaml30XM连接，得到表达载体pCaml30X。
[0099]2、转SRL2RNAi盐稻8号的获得
[0100] 1)重组菌构建
[0101] 将上述重组载体pSRL2RNAi通过电击转入农杆菌（AgroBacterium tumefaciens) EHA105中，得到重组菌EHA105/pSRL2RNAi (提取质粒，测序验证，含有pSRL2RNAi的菌为阳 性菌）。
[0102] 2)转 SRL2RNAi 盐稻 8 号
[0103] 将盐稻8号（以下简称为野生型水稻，中国水稻研究所国家水稻数据中心保藏，登 记编号苏审稻200307)个体幼胚脱壳灭菌，接种到诱导愈伤组织的培养基中。培养2周后， 挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。
[0104] 用重组菌EHA105/pSRL2RNAi菌液侵染水稻愈伤组织，在黑暗处25°C培养3天后， 在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处 练苗，7天后移栽到水田，得到TO代转SRL2RNAi盐稻8号。
[0105] 3)分子鉴定
[0106] 取TO代转SRL2RNAi盐稻8号和野生型水稻插秧后21的叶片，提取总RNA，采用 Bioteke公司RNA提取试剂盒（Bioteke，RP1201)按照说明书操作。以01igo(dt)_18为引 物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。通过qRT-PCR比较转基因植株 及野生型材料盐稻8号的叶片cDNA中SRL2基因的表达量，以水稻Ubiquitin基因的表达 量做参照。
[0107]扩增SRL2基因用引物对primer 5(5,-TCCATCTGCGCAGCAITTCA-3'）和primer6( 5' -CTACTGGGCACGATATGCAG-3'）；
[0108] 扩增 Ubiquitin 基因用引物对 primer 7 (5, -CAAGATGATCTGCCGCAAATGC-3'）和 primer 8(5,-TTTAACCAGTCCATGAACCCG-3,）〇
[0109] qRT-PCR扩增反应条件设置如下：
[0110] 反应体积20 yl，其中含有：模板（cDNA)ly l(25ng)，正向引物、反向引物终浓度 各0. 2 y M，dNTP终浓度各200 y M，Taq DNA聚合酶1U，10 X Taq DNA聚合酶缓冲液2 y 1， Sybgreen染料0? 5 y 1，用双蒸水补足至20 y 1体积。
[0111] 反应温度、时间设置为：95°C，变性5分钟；然后95°C变性10秒，56°C退火20秒， 72 °C延伸20秒。
[0112] 结果如图4所示，pSRL2RNAi为TO代转SRL2RNAi盐稻8号，WT为野生型水稻，可以 看出，与野生型水稻相比，pSRL2RNAi植株中SRL2基因的表达有明显下降，TO代转SRL2RNAi 盐稻8号为阳性转基因水稻，确实达到了干扰的效果。
[0113] 采用同样的方法将pCaml30X转入野生型水稻中，得到TO代转空载体水稻。
[0114] 3、转SRL2RNAi盐稻8号的表型观察
[0115] 将分子鉴定为阳性的TO代转SRL2RNAi盐稻8号、TO代转空载体水稻和野生型水 稻组培苗或秧苗种植在自然条件下出月-9月份）生长，抽穗后调查表型，同时计算倒二 叶的叶片卷曲指数LRI (leaf rolling index)，LRI=【（Lw_Ln)/Lw】*100%。其中Lw为叶 片展开时最宽处的宽度（cm)，Ln为叶片最宽处卷曲后两叶缘之间的距离（cm)。每个类型调 查5株，结果取平均值。
[0116] 表型如图3所示，pSRL2RNAi为TO代转SRL2RNAi盐稻8号，WT为野生型水稻，a和 b分别为植株表型和叶片表型，可以看出，与野生型水稻相比，阳性的TO代转SRL2RNAi盐稻 8号表现出像srl2突变体一样的典型的叶片呈半卷叶表型，野生型水稻为叶片不卷曲。
[0117] 进一步计算抽穗期倒二叶的叶片卷曲指数，结果如图5所示，野生型的叶片 卷曲指数为〇. 04 (4 % )，基本不卷曲；而TO代转SRL2RNAi盐稻8号的叶片卷曲指数为 0.4(40%),卷曲指数增加了 10倍。
[0118] TO代转空载体水稻结果与野生型水稻无显著差异。
【主权项】
1. 蛋白质SRL2或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、 重组菌或重组病毒在调控植物叶片卷曲中的应用； 所述蛋白质SRL2,是如下a)或b)的蛋白质： a) 由序列表中序列2所不的氣基酸序列组成的蛋白质； b) 将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有相同功能的由（a)衍生的蛋白质。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控植物叶片卷曲为促进植物叶片 卷曲。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植 物； 或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物为水稻。4. 蛋白质SRL2或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、 重组菌或重组病毒在培育叶片卷曲转基因植物中的应用。5. 抑制蛋白质SRL2表达的物质在调控植物叶片卷曲中的应用； 所述蛋白质SRL2,是如下a)或b)的蛋白质： a) 由序列表中序列2所不的氣基酸序列组成的蛋白质； b) 将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有相同功能的由（a)衍生的蛋白质。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述调控植物叶片卷曲为促进植物叶片 卷曲。7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述抑制蛋白质SRL2表达的物质为 如下： 1) 干扰蛋白质SRL2表达的DNA片段，其包括DNA片段1和DNA片段2,所述DNA片段 1的核苷酸序列为序列表中序列3第1-225位，所述DNA片段2的核苷酸序列为序列表中序 列3第433-656位； 或干扰蛋白质SRL2表达的DNA片段，其核苷酸序列为序列3 ; 2) 含有所述干扰片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。8. -种培育叶片卷曲转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中蛋白质SRL2 的表达，得到叶片卷曲转基因植物。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述抑制目的植物中蛋白质SRL2的表达 为将权利要求7中所述抑制蛋白质SRL2表达的物质导入目的植物。10. 根据权利要求5-7中任一所述的应用或8或9所述的方法，其特征在于：所述植物 为单子叶植物或双子叶植物； 或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物为水稻。
【专利摘要】本发明公开了蛋白SRL在培育叶卷曲水稻中的应用。本发明提供蛋白SRL在培育叶卷曲水稻中的应用；所述蛋白质SRL2，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。本发明的实验证明了SRL2基因可用于培育叶片适度卷曲的水稻品种，为水稻“理想株型”高产品种培育做出贡献。
【IPC分类】A01H5/12, C07K14/415, C12N15/29, C12N15/113, C12N15/82
【公开号】CN105175519
【申请号】
【发明人】程祝宽, 李明, 李亚非, 唐丁, 沈懿, 杜桂杰
【申请人】中国科学院遗传与发育生物学研究所
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月4日