蛋白srl2在培育叶卷曲水稻中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及蛋白SRL2在培育叶卷曲水稻中的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最主要的粮食作物之一，有近一半人口以稻米为主食，我国更高达 到60%以上。目前世界人口已经超过60亿，预计到2030年将可能达到80亿，与此同时， 每年转作其他用途的农田有近500万-1500万公顷.为了满足不断增长的人口对粮食总量 的需求，这就需要不断提高作物单产。因此，培育高产品种一直是育种家追求的永恒目标。
[0003] 水稻等作物的株型是决定其产量的核心因素之一。袁隆平的超高产杂交稻的理 想株型模式中，对叶片的要求为"长、直、窄、凹、厚"，其中"凹"即要求叶片要有一定的卷曲 度。水稻叶片的适度卷曲能提高叶片直立度，进而提高群体内透光率，改善群体中后期的基 部光照条件，最终提高作物产量。
[0004] 水稻叶片的卷曲类型可分为正卷和反卷，从卷曲程度上又可分为高度卷曲（成筒 状）、中度卷曲以及轻微卷曲。生产上需要的是叶片具有一定卷曲度的中度卷曲类型。水稻 卷叶资源可通过自然界水稻的自发突变获得，也可以通过EMS或辐射诱变人工创制。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供蛋白质SRL2或其编码基因或含有其编码基因的重组载 体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒的用途。
[0006] 本发明提供的蛋白质SRL2或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、表达盒、 转基因细胞系、重组菌或重组病毒在调控植物叶片卷曲中的应用；
[0007] 所述蛋白质SRL2,是如下a)或b)的蛋白质：
[0008] a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0009] b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能的由（a)衍生的蛋白质。
[0010] 上述应用中，所述调控植物叶片卷曲为促进植物叶片卷曲。
[0011] 上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
[0012] 或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物为水稻。
[0013] 蛋白质SRL2或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞 系、重组菌或重组病毒在培育叶片卷曲转基因植物中的应用也是本发明保护的范围。
[0014] 抑制蛋白质SRL2表达的物质在调控植物叶片卷曲中的应用也是本发明保护的范 围；
[0015] 所述蛋白质SRL2,是如下a)或b)的蛋白质：
[0016] a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0017] b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能的由（a)衍生的蛋白质。
[0018] 上述应用中，所述调控植物叶片卷曲为促进植物叶片卷曲。
[0019] 上述应用中，所述抑制蛋白质SRL2表达的物质为如下：
[0020] 1)干扰蛋白质SRL2表达的DNA片段，其包括DNA片段1和DNA片段2,所述DNA 片段1的核苷酸序列为序列表中序列3第1-225位，所述DNA片段2的核苷酸序列为序列 表中序列3第433-656位；
[0021] 2)含有所述干扰片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
[0022] 上述应用中，上述干扰片段的核苷酸序列为序列3。
[0023] 本实施例中是将含有所述干扰片段的重组载体导入水稻。
[0024] 含有所述干扰片段的重组载体为将序列表中序列3替换pCaml30X载体骨架Pst I 和Sal I酶切位点间的DNA片段得到的重组载体，其中序列3第1-225位为DNA片段1、第 433-656位为DNA片段2、第226-432位为DNA片段3。该重组载体命名为pSRL2RNAi，即为 RNAi干扰载体。
[0025] pCaml30X载体为将组成型CaMV35S启动子片段插入pCAMBIA1300的Pst I和Hind III酶切位点，且将277bp的NOS终止子片段插入pCAMBIA1300的EcoR I和Sac I酶切位 点，得到的载体。
[0026] 本发明的另一个目的是提供一种培育叶片卷曲转基因植物的方法。
[0027] 本发明提供的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中蛋白质SRL2的表达，得到叶 片卷曲转基因植物。
[0028] 上述方法中，所述抑制目的植物中蛋白质SRL2的表达为将上述抑制蛋白质SRL2 表达的物质导入目的植物。
[0029] 上述应用或方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
[0030] 或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物为水稻。
[0031] 序列表中序列2由988个氨基酸残基组成。
[0032] 上述蛋白质SRL2编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：
[0033] 1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
[0034] 2)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至 少具有85 %、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 % 或至少具有99 %同源性且编码上述蛋白质的DNA分子；
[0035] 3)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码上述蛋白质的DNA 分子。
[0036] 序列表中的序列1由2967个碱基组成，其开放阅读框架（ORF)为自5'末端第 1-2967位核苷酸。
[0037] 上述严格条件可为在0.1 X SSPE (或0.1 XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C条件 下杂交并洗月吴。
[0038] 上述含有蛋白质SRL2编码基因的重组载体也属于本发明的保护范围。
[0039] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
[0040] 所述植物表达载体包括双元农杆菌载体（如pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、 PCAMBIA3301、pCAMBIA1301-UbiN、pCAMBIA1300等）和可用于植物微弹轰击的载体等。所 述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参 与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体 的3'端，如农杆菌冠癭瘤诱导（Ti)质粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大 豆贮存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
[0041] 使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种 增强型启动子、组成型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV) 35S启动子、玉米 的泛素启动子（Ubiquitin)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植 物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括 翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子 等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起 始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起 始区域或结构基因。
[0042] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、 萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是 抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选 择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0043] 利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导 入植物细胞，可获得半卷叶表型的转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载 体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导 等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0044] 本发明通过C〇60辐射籼稻品种中籼3037种子，得到一个半卷叶突变体， SRL2 (Semi-Rolled Leaf)，该突变体与野生型中籼3037相比，主要变现为叶片向上半卷，同 时株高略有降低，叶片变窄。遗传分析表明该突变表型由一个隐性核基因控制。通过构建 定位群体，利用图位克隆的方法，获得了控制这一性状的基因。序列比较表明，该基因编码 一个植物特有的未知功能蛋白，目前水稻中尚无这类基因突变影响叶片卷曲的报道，说明 这是一个控制水稻叶片形态的新基因。这一新突变体的获得，对了解水稻叶片形态建成机 制具有重要的应用价值。
[0045] 本发明还通过干扰野生型水稻中的SRL2基因表达，得到转基因水稻，其与未干扰 的野生型水稻相比，发生叶片卷曲。因此，SRL2基因可用于水稻高产育种，丰富现有的水稻 育种材料的遗传多样性。本发明水稻半卷叶蛋白SRL2,可用于培育叶片适度卷曲的水稻品 种，为水稻"理想株型"高产品种培育做出贡献。
【附图说明】
[0046] 图1为3037与突变体srl2的植株和叶片表型观察。
[0047] 图2为SRL2基因的定位及互补表达载体的构建。
[0048] a. SRL2基因位点被定位到水稻3号染色体短臂上的分子标记S3和S4之间。
[0049] b. SRL2基因的结构。黑色代表外显子，该基因只有19个外显子。箭头标示的是缺 失一个碱基T的位点。
[0050] c.互补表达载体的构建。pCSRL2,互补表达载体，包括SRL2基因上游7674bp和下 游2592bp ;pCSRL2-CK，互补表达载体对照，与pCS