RL2相比少了 SRL2基因的部分启动子区、 整个编码区和3'调控区。
[0051] 图3为3037与SRL2基因RNA干扰转基因植株和叶片的表型。
[0052] 图4为野生型盐稻8号和pSRL2RNAi植株在插秧移栽后21天，叶片中SRL2基因 表达量。
[0053] 图5为野生型盐稻8号和pSRL2RNAi植株在抽穗期，倒二叶片的卷曲指数计算。
【具体实施方式】
[0054] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0055] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0056] 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0057]实施例1、水稻半卷叶突变体srl2的表型及遗传分析
[0058] 1、水稻半卷叶突变srl2的表型分析
[0059] 水稻半卷叶突变体srl2是本实验室通过C〇60辐射籼稻品种中籼3037 (WT，购自扬 州大学农学院）种子，得到一个半卷叶突变体。srl2与对照3037相比，叶片明显呈半卷 叶状态（图1，a和b分别为对照3037 (左）与srl2 (右）在幼苗期和成熟期植株整体的表 型，c为叶片表型，d为叶片的徒手切片显微观察，e为叶片的扫描电镜超微结构观察）。切 片观察发现，突变体叶肉细胞的分化和分布明显不同于野生型。与野生型相比，突变体叶片 在卷曲地方的小维管束背面没有厚壁组织的形成；而那些大的维管束的截面形态则与野生 型没有明显差别。进一步扫描电镜超微结构观察发现，srl2叶片正面的表皮细胞与野生型 相比没有明显差别，而叶片背面的表皮细胞，在一些小的维管束中则缺少由哑铃型硅质细 胞形成的纵列。因此，在突变体中，正是由于在一些叶片维管束背部缺乏厚壁组织细胞的分 化，导致了卷叶的表型。
[0060] 2、水稻半卷叶突变体srl2的遗传分析
[0061] 水稻半卷叶突变srl2与粳型野生型水稻材料（Japonica)日本晴（中国农科院作 物科学研究所水稻种质资源中心保藏，库编号11A13071)，配置杂交获得Fl代，Fl代自交产 生F2代群体。对F2代群体内各植株进行叶片卷曲与否的表型观察，日本晴和srl2分别作 为正、负对照。F2代植株的表型鉴定结果如表1所示，表明水稻半卷叶这一性状符合单基因 控制遗传规律。表1中，正常株数是指具有日本晴表型的株数，srl2株数是指具有srl2表 型的株数。
[0062] 表1水稻半卷叶突变体srl2的遗传分析
[0063]
[0064] 实施例2、SRL2基因的获得
[0065] 1、图位克隆SRL2的基因组DNA
[0066] 为了克隆SRL基因，将水稻半卷叶突变体srl2和日本晴配置杂交组合，获得的杂 交Fl代自交得到F2群体，对其中2994个F2隐性个体（具有半卷叶表型的F2代个体）进 行SRL基因的精细定位。利用实验室已开发的STS (Sequence-Tagged Site)分子标记（表 2)，通过PCR的方法，首先将SRL基因定位于第3染色体长臂上的STS标记Sl和S6之间。 进一步，利用STS标记S2, S3, S4和S5,最终将SRL基因精细定位在BAC克隆AC134769上 56Kb 范围内，利用水稻基因组注解数据库 RiceGAAS(http://ricegaas. dna. affrc. go. jp/ rgadb)分析表明，56kb区域内共有3个基因（图2a)，将这3个基因进行DNA序列测定，比 较了突变体和野生型序列，发现其中2个基因在突变体中的序列都与野生型的一致，只有 基因L0C_0s03gl9520在第15个外显子发生了一个碱基T的缺失，最终导致翻译蛋白的改 变和提前终止。因此，将突变的L0C_0s03gl9520确定为目标基因，命名为SRL2。图2b为 SRL2基因结构，图中标记为基因的突变位点。
[0067] 表2本研究新创制的STS标记
[0068]
[0069] 2、SRL2基因全长ORF的获得
[0070] 用Bioteke公司RNA提取试剂盒（Bioteke，RP1201)提取水稻日本晴叶片 总RNA，采以01ig 〇(dt)-18为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一 链 cDNA。以此 cDNA 为模板，primer 1(5' -ATGGGTITCATGTCAGCGAA-3' ）和 primer 2(5' -CTACTGGGCACGATATGCAGC-3'），进行PCR扩增反应，反应条件如下：
[0071] 反应体积50yl，其中含有：模板（cDNA)5yl(5ng)，引物正向引物、反向引物终浓 度各0.2 yM，dNTP终浓度各200 yM，Ex Taq DNA聚合酶2. 5U，10 X Ex Taq DNA聚合酶缓冲 液5 y 1，用双蒸水补足至50 y 1体积。
[0072] 反应温度、时间：94°C，变性5分钟；然后94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延 伸3分钟，扩增35个循环；最后在72°C下延伸10分钟。
[0073] 扩增产物为3'有碱基A的3'突出粘端片段，用QIAquick胶回收试剂盒（Qiagen， 28706)按产品说明书进行纯化，然后与3'有碱基T的线性pGEM-T EASY载体（Promega， A1360)在16°C下连接6小时，使用2mm电极杯，2500V转化大肠杆菌DH5 a，转化物在含氨 苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，使用AbI PRISM 3700DNA分析仪 (Perkin-Elmer/Applied Biosystem)测序。
[0074] 扩增产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，为SRL2基因全长0RF，长2967bp，该 基因编码的蛋白命名为SRL2,该蛋白的氣基酸序列为序列表中序列2所不。
[0075] 实施例3、用突变体SRL2互补实验验证基因SRL2的功能
[0076]1、互补载体pCSRL2及互补对照载体pCSRL2-CK的构建
[0077]利用EcoRI酶切BAC AC134769 (购自中科院上海国家基因研究中心），获得包含 有SRL2的起始密码子ATG上游的7674个碱基和终止密码子TGA后的2592个碱基的全长 序列的 DNA 片段（16934bp)，克隆到 pCAMBIA1300 (DingGuo, MCV033) EcoRI 位点，即构建成了 互补表达载体PCSRL2 (图2c)。
[0078] 将构建好的互补载体pCSRL2用XholI酶切，去除SRL2基因的部分启动子区、整个 编码区和3'调控区，保留5'端的部分启动子区，即构建成了互补对照载体pCSRL2-CK(图 2c) 〇
[0079] 2、pCSRL2和pCSRL2-CK转化株系的获得及其表型鉴定
[0080] 两载体pCSRL2和pCSRL2_CK通过电击的方法分别转入农杆菌（AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105(北京亚平宁生物）中，利用农杆菌的介导法分别将pCSRL2和 PCSRL2-CK转入半卷叶突变体srl2中。
[0081] 转化的具体方法是将突变体个体幼胚脱壳灭菌，接种到诱导愈伤组织的培养基 中。培养2周后，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。用 含有PCSRL2和pCSRL2-CK质粒的EHA105菌株分别侵染水稻愈伤组织，在黑暗处25°C培养 3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织和转基因植株。将潮霉素 抗性植株在阴凉处练苗，7天后移栽到水田。观察转基因植株的表型恢复情况。
[0082] 结果表明转入互补载体pCSRL2的植株能恢复叶片不卷曲的野生型表型，而转入 互补对照载体PCSRL2-CK的植株仍为半卷叶，不能恢复表型。功能互补实验表明SRL2控制 水稻半卷叶表型。
[0083] 实施例4、用RNA干扰实验验证基因SRL2的功能
[0084] 1、表达SRL2基因RNA干扰质粒pSRL2RNAi
[0085] 用Bioteke公司RNA提取试剂盒（Bioteke，RP1201)提取水稻日本晴叶片总RNA， 采以Olig 0 (dt)-18为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。以此 cDNA 为模板，用引物对 primer 3 (5 ' -GCCCAAGCTCGCGGCGCCCTG-3 '）和 primer4 (5 ' -TGCAAA TGAAGAGTAGCTTG-3'）进行PCR反应扩增，反应条件如下：
[0086] 反应体积50yl，其中含有：模板（cDNA)5yl(5ng)，引物正向引物、反向引物终浓 度各0. 2 y M，dNTP终浓度各200 y M，Pfu DNA聚合酶2. 5U，10 X DNA聚合酶缓冲液5 y 1，用 双蒸水补足至50 y 1体积。
[0087]反应温度、时间：94°C，变性5分钟；然后94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延 伸40秒，扩增35个循环；最后在72 °C下延伸3分钟。
[0088] 扩增产物为3'有碱基A的3'突出粘端片段，用Biomed胶回收试剂盒（Biomed， 28706)按产品说明书进行纯化，然后连入3'有碱基T的线性pMD19-T(Takara，D101)载体 中得到载体PMD19-SRL2。
[0089]用Sal I和BamH I酶切载体pMD19-SRL2,得到225bp的DNA片段1 ;
[0090]用 PstI和Xba I酶切载体pMD19-SRL2,得到224bp的DNA片段2 ;
[0091] 用Bgl II和Xba I双酶切载体pUCCRNAi，得到219bp的DNA片段3 ;
[0092] pUCCRNAi 载体记载在如下文献中：参见 "Hengxiu Yu，