)，TNBP (磷酸三丁酯）至3% (wt% ))350克，搅匀后升温至24-26°C，后保温6小时；
[0061] 6)将S/D后溶液降温至10°C，用稀释液（0.0 lM Na-citrate溶液，PH7. 05)稀释 上述溶液，然后上Capto-Q层析柱，层析柱预先用平衡缓冲液（0.0 lM Na-citrate，0. 15M NaCL溶液，PH7. 05)充分平衡；上柱结束后用平衡缓冲液冲洗，后用洗涤缓冲液（0.0 lM Na-citrate，0.25M NaCL 溶液，PH6.20)洗涤，再用洗脱缓冲液（0.01M Na-citrate，0.02M Arginine Hydrochloride，0.6M NaCL 溶液，PH7. 05)洗脱，收集洗脱液，用 0.45 ym 滤芯过 滤；
[0062] 7)用稀释液（0? OlM Na-citrate，0? 02M Arginine Hydrochloride，PH6. 50-7. 50) 稀释以上洗脱液，然后上Heparin Sepharose 6FF柱，层析柱预先用平衡缓冲液充分平衡， 平衡缓冲液为〇. OlM Na-citrate，0. 15M NaCL溶液（PH7. 15)，后用洗涤缓冲液（0. 02M Na-citrate，0.25M NaCL 溶液，PH7. 15)洗涤，再用洗脱缓冲液（0.02M Na-citrate，0.02M Arginine Hydrochloride，0? 65M NaCL 溶液，PH7. 15)洗脱，收集洗脱液 739 克，用 0? 45 y m 滤芯过滤洗脱液得到滤液692g ;
[0063] 8)用IOk分子量的超滤膜（0.1 M2)浓缩洗脱液至约300ml，后用1. 5升透析液 (0.0 lMNa-citrate，0.1 MNaCL溶液，PH7. 15)恒体积透析，再次浓缩并移出超滤膜包，得到 浓缩液218克，测得FIX活力38IU/ml ;
[0064] 9)调节人凝血因子IX含量至30IU/ml，根据计算，称取盐酸精氨酸4. 2克，甘氨酸 4. 2克，加入步骤9所述透析液50克，将盐酸精氨酸、甘氨酸加入透析液溶解，后加到步骤9 所述浓缩液中，然后调PH值至7. 15,并加入肝素钠至0. 2IU/单位九因子；
[0065] 10)用20纳米滤芯进行除病毒过滤；
[0066] 11)用0. 22ym滤芯对广品进彳丁除囷过滤并分装，IOml/瓶；
[0067] 12)冻干；
[0068] 13)在100°C沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活；测FIX活力，27. lIU/ml。
[0069] 试制品FIX收率及比活一览表
[0070]
【主权项】
1. 一种高纯人凝血因子IX的制备方法，其特征在于包括如下步骤： 1) 将新鲜冰冻血浆融浆后离心去除冷沉淀，获得去冷胶血浆，然后将去冷胶血浆加热 至 10-15。。； 2) 将DEAE-S印hadexA-50凝胶置于一个不锈钢树脂桶中，先用温度在75~85°C的 注射用水充分溶胀，再用10~20°C的注射用水冷却，然后用缓冲液平衡，所述的缓冲液由 Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0. 005M-0. 015M、NaCL 的浓度为〇. 075M-0. 15M，所述的缓冲液的PH为6. 50-7. 50,将上述平衡好的凝胶加入到去 冷胶血浆中，按照每升去冷胶血浆加入0. 5-1. 5克干凝胶的比例加入平衡好的凝胶，搅拌 0. 5-1. 5小时，再静置10-20分钟； 3) 过滤去冷胶血浆，收集吸附了凝血因子IX的DEAES印hadexA-50凝胶，后用洗涤 缓冲液冲洗树脂4-6次，所述的洗涤缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的洗涤缓冲 液中，Na-citrate的浓度为0. 005M-0. 015M、NaCL的浓度为0. 1M-0. 25M，所述的洗涤缓冲 液的PH为6. 50-7. 50,再用洗脱缓冲液洗脱树脂2-4次，所述的洗脱缓冲液由Na-citrate、 ArginineHydrochloride和NaCL组成，在所述的洗脱缓冲液中，Na-citrate的浓度为 0? 005M-0. 015M、ArginineHydrochloride的浓度为 0? 02M、NaCL的浓度为 0? 5M-2. 0M，所 述的洗脱缓冲液的PH为6. 50-7. 50,收集洗脱液，然后用0. 45ym或I. 0ym滤芯过滤洗脱 液，收集滤液，即为凝血因子IX粗品溶液； 4) 在过滤后的洗脱液中加入聚乙二醇，加入后的聚乙二醇在洗脱液中的质量百分比浓 度为2-6%，搅拌0.5-1. 5小时，过滤； 5) 在上述的滤液中加入Tween80,加入后的Tween80在上述滤液中的质量百分比浓 度为L〇%，再加入磷酸三丁酯，加入后的磷酸三丁酯在上述滤液中的质量百分比浓度为 0. 3%，搅匀后升温至24-26°C，后保温6~7小时； 6) 然后降温至5-15°C，用第一稀释液稀释至电导率不高于15mS/cm，所述的第一稀 释液为0.OlMNa-citrate溶液，所述的第一稀释液的PH6. 2-7. 20,然后上阴离子交换 柱，所述的阴离子交换柱预先用平衡缓冲液充分平衡，所述的平衡缓冲液由Na-citrate 和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0. 005M-0. 015M、NaCL的浓度为 0. 1M-0. 15M，所述的平衡缓冲液的PH为6. 20-7. 20 ;再用洗涤缓冲液洗涤，所述的洗涤 洗涤缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的洗涤缓冲液中，Na-citrate的浓度为 0. 005M-0. 015M、NaCL的浓度为0. 18-0. 3M，所述的洗涤缓冲液的PH为6. 20-7. 20,再用洗 脱缓冲液洗脱，所述的洗脱缓冲液由Na-citrate、ArginineHydrochloride、和NaCL组成， 在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为 0. 005M-0. 015M、ArginineHydrochloride的浓 度为0. 02M、NaCL的浓度为0. 5M-1. 0M，所述的洗脱缓冲液的PH为6. 80-7. 80,收集洗脱液 即为纯化的凝血因子IX溶液； 7) 用第二稀释液稀释步骤6)的洗脱液至电导率不高于15mS/cm，所述的第二稀释由 Na-citrate、ArginineHydrochloride组成，在所述的稀释液中，Na-citrate的浓度为 0? 01M、ArginineHydrochloride的浓度为 0? 02M，所述的第二稀释液的PH为 6. 50-7. 50， 然后上肝素亲和柱，所述的肝素亲和柱预先用平衡缓冲液充分平衡，所述的平衡缓冲液 由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0. 01M-0. 02M、 NaCL的浓度为0. 1M-0. 15M，所述的平衡缓冲液为PH6. 50-7. 50,再用洗涤缓冲液洗涤，所 述的洗涤缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为 0. 01M-0. 02M、NaCL的浓度为0. 18-0. 25M，所述的洗涤缓冲液的PH为6. 50-7. 50,再用洗脱 缓冲液洗脱，所述的洗脱缓冲液由Na-citrate、ArginineHydrochloride和NaCL组成，在 所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0. 01M-0. 02M、ArginineHydrochloride的浓度为 0. 02M、NaCL的浓度为0. 4M-1. 0M，所述的洗脱缓冲液的PH为6. 50-7. 50,收集洗脱液，用 0. 45ym或0. 22ym滤芯过滤以上洗脱液，所得滤液即为高纯凝血因子IX溶液； 8) 用IOk分子量的超滤膜浓缩以上滤液，然后恒体积透析，再浓缩至凝血因子IX活力 高于35IU/ml，得到凝血因子IX浓缩液； 9) 调节人凝血因子IX含量至20-30IU/ml，然后调PH值至6. 50-7. 50,并加入肝素钠 至0. 1-0. 4IU/单位FIX，加入盐酸精氨酸和甘氨酸，所述的盐酸精氨酸在凝血因子IX浓缩 液中的质量百分比浓度为〇. 5-3%，所述的甘氨酸在凝血因子IX浓缩液中的质量百分比浓 度为 0.5-3% ; 10) 用20纳米滤芯进行除病毒过滤； 11) 用〇. 22ym滤芯对广品进彳丁除囷过滤并分装； 12) 冻干； 13) 在KKTC沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活，得到高纯人凝血因子IX。2. 根据权利要求1所述的一种高纯人凝血因子IX的制备方法，其特征在于：步骤6) 中，所述的阴离子交换柱为Capt〇-Q、Q_SepharoseFF、Q_Sepharose4FF、Q_SepharoseHP、 Q-SepharoseXL、DEAE-SepharoseFF、或者Capto-DEAE层析柱。3. 根据权利要求I所述的一种高纯人凝血因子IX的制备方法，其特征在于：所述的肝 素亲和柱为HeparinSepharose6FF、HeparinSepharoseCL_6B〇
【专利摘要】本发明一种高纯人凝血因子IX的制备方法，包括冰冻血浆融化后的低温离心；DEAE？Sephadex？A-50凝胶吸附去冷胶血浆中的凝血因子IX；聚乙二醇去除溶液中杂蛋白；S/D病毒灭活；阴离子交换柱层析得到纯化的凝血因子IX溶液；再上肝素亲和柱进一步层析得到高纯凝血因子IX溶液；超滤、透析、浓缩并加入盐酸精氨酸和甘氨酸作为保护剂；20纳米滤芯过滤去除病毒；冻干；干热病毒灭活。本发明在凝胶吸附、柱层析、超滤透析操作均加入了蛋白保护剂，降低了FIX制品凝血酶激活的概率，提高了产品的合格率；本发明工艺产品得率高，FIX比活可达150IU/mg左右，远高于传统产品，且经三步病毒灭活，产品使用安全可靠。
【IPC分类】C07K1/34, C07K1/22, C07K1/18
【公开号】CN105175486
【申请号】
【发明人】李春洲
【申请人】上海洲跃生物科技有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月20日