工艺具 有产品得率高、比活高的优点，产品经三步病毒灭活，使用安全可靠。
【附图说明】
[0023] 图1是本发明的一种制备高纯人凝血因子IX的工艺流程框图。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1
[0025] 一种高纯人凝血因子IX的制备方法，包括如下步骤：
[0026] 1)取冰冻血浆35袋，表面用70%乙醇淋洗并用冷注射用水冲洗后，割袋，倒入不 锈钢融浆桶中，在0-3°C水浴中融化，后精确称取20kg，离心去除冷沉淀，获得去冷胶血浆 19. 8kg，然后置于15°C水浴中加热去冷胶血浆至13-15°C;
[0027] 2)称取20克DEAE-S印hadex A-50凝胶置于凝胶桶中，先用约2kg热注射用水（约 80°C )充分溶胀，再用约2kg冷注射用水（约15°C )冲洗冷却，后用约Ikg缓冲液（PH6. 50， 0.0 lM Na-citrate，0. 075M NaCL，15°C )平衡，然后加到去冷胶血浆中，缓慢搅拌1小时，后 静置10分钟；
[0028] 3)在凝胶桶中用滤布过滤去冷胶血浆，收集DEAE-Sephadex A-50凝胶，然后在凝 胶桶中加入2升洗涤缓冲液（PH6. 50,0.0 lM Na_citrate，0.1 M NaCL)搅拌约10分钟，后 经滤布过滤后从桶底放掉洗涤液，如此反复冲洗凝胶4次，再用洗脱缓冲液（PH6. 50,0.0 lM Na_citrate，0.02M Arginine Hydrochloride，0.5M NaCL)洗脱凝胶 3 次，每次 2 升，收集洗 脱液约2005g，用0. 45 y m滤芯过滤洗脱液，，去除碎胶微粒，得到滤液1950克；
[0029] 4)称取PEG (聚乙二醇）65克，先溶于65克注射用水中，后加入到滤液中，搅拌0.5 小时后过滤，收集滤液2036克；
[0030] 5)以上滤液中加入S/D母液（即Tween8010% (wt% )，TNBP (磷酸三丁酯）至3% (wt% ))225克，搅匀后升温至24-26°C，后保温6小时；
[0031] 6)将S/D后溶液降温至5°C，用稀释液（0.0 lM Na-citrate溶液，PH6. 20)稀释上 述溶液至原溶液重量的3. 5倍，然后上阴离子交换柱Q-S印harose FF，层析柱预先用平衡 缓冲液（〇. OlM Na-citrate，0.1 M NaCL溶液，PH6. 20)充分平衡；上柱结束后用平衡缓冲液 冲洗柱子，后用洗涤缓冲液（0.01M Na-citrate，0. 18M NaCL溶液，PH6. 20)洗涤，再用洗脱 缓冲液（〇? OlM Na_citrate，0.02M Arginine Hydrochloride，0.5M NaCL 溶液，PH6. 80)洗 脱，收集洗脱液用〇. 45 y m滤芯过滤；
[0032] 7)用稀释液（0? OlM Na-citrate，0? 02M Arginine Hydrochloride，PH6. 50-7. 50) 稀释以上滤液，然后上Heparin Sepharose 6FF柱，层析柱预先用平衡缓冲液充分平衡， 平衡缓冲液为〇. OlM Na-citrate，0. 15M NaCL溶液（PH6. 80)，后用洗涤缓冲液（0.0 lM Na-citrate，0. 18M NaCL 溶液，PH6.80)洗涤，再用洗脱缓冲液（0.01M Na-citrate，0.02M Arginine Hydrochloride，0? 5M NaCL 溶液，PH6. 80)洗脱，收集洗脱液 810 克，用 0? 45 y m 滤芯过滤洗脱液得到滤液772g ;
[0033] 8)用IOk分子量的超滤膜（0.IM2)浓缩洗脱液至约300ml，后用1. 5升透析液 (0.OlMNa_citrate，0.IMNaCL溶液，PH7. 00)恒体积透析，再次浓缩并移出超滤膜包，得到 浓缩液245克，测得FIX活力35.llU/ml;
[0034] 9)调节人凝血因子IX含量至30IU/ml，根据计算，称取盐酸精氨酸1. 5克，甘氨酸 8. 3克，加入步骤9所述透析液23克，将盐酸精氨酸、甘氨酸加入透析液悬浮，后加到步骤9 所述浓缩液中，然后调PH值至7. 00,并加入肝素钠至0. 15IU/单位九因子；
[0035] 10)用20纳米滤芯进行除病毒过滤；
[0036] 11)用0. 22ym滤芯对广品进彳丁除囷过滤并分装，IOml/瓶；
[0037] 12)冻干；
[0038] 13)在100°C沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活；测FIX活力，28. llU/ml ;
[0039] 实施例2
[0040] -种高纯人凝血因子FIX的制备方法，包括如下步骤：
[0041] 1)同实施例1;
[0042] 2)DEAE-S印hadex A-50凝胶的用量、溶胀与冷却同实施例1，后用约Ikg缓冲液 (PH7. 35,0.0 lM Na-citrate，0. 15M NaCL，15°C )平衡，然后加到去冷胶血浆中，缓慢搅拌1 小时，后静置20分钟；
[0043] 3)在凝胶桶中用滤布过滤去冷胶血浆，收集DEAE-Sephadex A-50凝胶，然后在凝 胶桶中加入2升洗涤缓冲液（PH7. 35,0. 015M Na_citrate，0. 2M NaCL)搅拌约5分钟，后经 滤布过滤后从桶底放掉洗涤液，如此反复冲洗凝胶6次；再用洗脱缓冲液（PH7. 35,0. 015M Na_citrate，0. 02M Arginine Hydrochloride，1.0 M NaCL)洗脱凝胶 4 次，每次 1 升，收集洗 脱液约3988g，用0. 45 y m滤芯过滤洗脱液，得到滤液3936克；
[0044] 4)称取PEG (聚乙二醇）260克，先溶于260克注射用水中，后加入到滤液中，搅拌 1. 5小时后过滤，收集滤液4402克；
[0045]5)以上滤液中加入S/D母液（即Tween8010% (wt% )，TNBP (磷酸三丁酯）至3% (wt% ))500克，搅匀后升温至24-26°C，后保温6小时；
[0046]6)将S/D后溶液降温至15 °C，用稀释液（0.0 lM Na-citrate溶液，PH7. 20)稀释 上述溶液至电导率13. 8ms/cm，然后上DEAE-Sepharose FF层析柱，层析柱预先用平衡缓冲 液（0.0 lM Na-citrate，0. 15M NaCL溶液，PH7. 20)充分平衡；上柱结束后用平衡缓冲液冲 洗，后用洗涤缓冲液（0.01M Na-citrate，0. 3M NaCL溶液，PH7. 20)洗涤，再用洗脱缓冲液 (0? OlM Na_citrate，0.02M Arginine Hydrochloride，1.0M NaCL溶液，PH7. 80)洗脱，收集 洗脱液，用0. 45 y m滤芯过滤；
[0047] 7)用稀释液（0? OlM Na-citrate，0? 02M Arginine Hydrochloride，PH7. 50)稀 释以上滤液，然后上Heparin Sepharose CL-6B柱，层析柱预先用平衡缓冲液充分平衡， 平衡缓冲液为〇. OlM Na-citrate，0. 15M NaCL溶液（PH7. 50)，后用洗涤缓冲液（0.0 lM Na-citrate，0? 2M NaCL，PH7. 50)洗涤，再用洗脱缓冲液（0? OlM Na-citrate，0? 02M Arginine Hydrochloride，1.0 M NaCL，PH7. 50)洗脱，收集洗脱液 764 克，用 0? 45 y m 滤芯 过滤洗脱液得到滤液713g ;
[0048] 8)用IOk分子量的超滤膜（0.1 M2)浓缩洗脱液至约300ml，后用1. 5升透析液 (0.0 lM Na-citrate，0.1 M NaCL溶液，PH7. 50)恒体积透析，再次浓缩并移出超滤膜包，得到 浓缩液237克，测得FIX活力36IU/ml ;
[0049] 9)调节人凝血因子FIX含量至30IU/ml，根据计算，称取盐酸精氨酸8. 6克，甘氨 酸1. 5克，加入步骤9所述透析液48克，将盐酸精氨酸、甘氨酸加入透析液溶解，后加到步 骤9所述浓缩液中，然后调PH值至7. 00,并加入肝素钠至0. 3IU/单位九因子；
[0050] 10)用20纳米滤芯进行除病毒过滤；
[0051] 11)用0. 22ym滤芯对产品进行除菌过滤并分装，IOml/瓶；
[0052] 12)冻干；
[0053] 13)在100°C沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活；测FIX活力，27. 8IU/ml。
[0054] 实施例3
[0055] -种高纯人凝血因子IX的制备方法，包括如下步骤：
[0056] 1)同实施例1 ;
[0057] 2)DEAE-S印hadex A-50凝胶的用量、溶胀与冷却同实施例1，后用约Ikg缓冲液 (PH7. 05,0.0 lM Na_citrate，0. 10M NaCL，15°C )平衡，然后加到去冷胶血浆中，缓慢搅拌1 小时，后静置20分钟；
[0058] 3)在凝胶桶中用滤布过滤去冷胶血浆，收集DEAE-Sephadex A-50凝胶，然后在凝 胶桶中加入2升洗涤缓冲液（PH7. 05,0.0 lM Na-citrate，0. 15M NaCL)搅拌约8分钟，后 经滤布过滤后从桶底放掉洗涤液，如此反复冲洗凝胶5次，再用洗脱缓冲液（PH7. 05,0.0 lM Na_citrate，0. 02M Arginine Hydrochloride，0? 65M NaCL)洗脱凝胶 3 次，每次 1 升，收集 洗脱液约2955g，用0. 45 y m滤芯过滤洗脱液，得到滤液2904克；
[0059] 4)称取PEG(聚乙二醇）130克，先溶于130克注射用水中，后加入到滤液中，搅拌 1小时后过滤，收集滤液3108克；
[0060] 5)以上滤液中加入S/D母液（即Tween8010% (wt%