一种高纯人凝血因子ix的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，涉及一种人凝血因子IX，具体来说是一种高纯人凝血 因子IX的制备方法。
【背景技术】
[0002] 人凝血因子IX(FIX)是人体十三种凝血因子中的一种，在人体凝血机制中扮演非 常重要的作用。因缺乏凝血因子IX而导致凝血障碍即为乙型血友病，该病是一种遗传性疾 病，患者以男性为主，发病率约为男性活婴的1/30000,以自发性或创伤相关的出血为特征， 出血部位主要在关节、软组织和肌肉。治疗的延迟或不足会引起各种并发症，包括关节反复 出血相关的关节病和滑膜炎，严重时可导致关节畸形和功能障碍。另外，更严重的出血，尤 其是颅内出血可能导致死亡。
[0003] 目前治疗乙型血友病唯一有效的方法就是及时注射含凝血因子FIX的药物以达 到止血的目的，或者规律性注射含凝血因子IX的药物预防出血。含凝血因子FIX的药物有 血浆提取的人凝血因子FIX、人凝血酶原复合物以及基因重组的人凝血因子IX等，国外有 冻干人凝血因子IX及重组人凝血因子IX制品，国内目前只有冻干人凝血酶原复合物品种。 临床实践表明，乙型血友病人可以自我注射纯的人凝血因子IX，通常不会有副作用，是比较 安全的，但是注射人凝血酶原复合物却可能产生严重的副作用一血栓症，所以一般乙型血 友病人输注该药时需在医院注射，留院观察以防意外。可见，纯化的人凝血因子FIX是治 疗乙型血友病的首选药物，但传统的纯化人凝血因子IX生产工艺，工序较多，成本很高，且 在生产过程中易出现凝血酶激活的问题而致产品失败，再加上传统工艺的病毒灭活手段单 一，不能完全保证制品的安全，而干热病毒灭活方式往往导致较大的活力损失，所以，长期 以来，纯化的人凝血因子IX -直未能取代虽有副作用但成本低廉的人凝血酶原复合物，
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种高纯人凝血因子IX的制备 方法，所述的这种高纯人凝血因子IX的制备方法解决了现有技术中制备人凝血因子IX的 方法工序复杂、成本高，产品安全性不高的技术问题。
[0005] 本发明提供了一种高纯人凝血因子IX的制备方法，包括如下步骤：
[0006] 1)将新鲜冰冻血浆融浆后离心去除冷沉淀，获得去冷胶血浆，然后将去冷胶血浆 加热至l〇_15°C;
[0007] 2)将DEAE-S印hadexA-50凝胶置于一个不锈钢树脂桶中，先用温度在75~ 85°C的注射用水充分溶胀，再用10~20°C的注射用水冷却，然后用缓冲液平衡，所述的缓 冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate(柠檬酸钠）的浓度为 0. 005M-0. 015M、NaCL的浓度为0. 075M-0. 15M，所述的缓冲液的PH为6.50-7. 50,将上述平 衡好的凝胶加入到去冷胶血浆中，按照每升去冷胶血浆加入〇. 5-1. 5克干凝胶的比例加入 平衡好的凝胶，搅拌〇. 5-1. 5小时，再静置10-20分钟；
[0008] 3)过滤去冷胶血衆，收集吸附了凝血因子IX的DEAE-S印hadex A-50凝胶，后用 洗涤缓冲液冲洗树脂4-6次，所述的洗涤缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲 液中，Na-citrate的浓度为0. 005M-0. 015M、NaCL的浓度为0. 1M-0. 25M，所述的洗涤缓冲 液的PH为6. 50-7. 50 ;再用洗脱缓冲液洗脱树脂2-4次，所述的洗脱缓冲液由Na-citrate、 Arginine Hydrochloride (盐酸精氨酸）和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓 度为 0? 005M-0. 015M、Arginine Hydrochloride 的浓度为 0? 02M、NaCL 的浓度为 0? 5M-2. 0M， 所述的洗脱缓冲液的PH为6. 50-7. 50,收集洗脱液，然后用0. 45 y m或I. 0 y m滤芯过滤洗 脱液，收集滤液，即为凝血因子IX粗品溶液；
[0009] 4)在过滤后的洗脱液中加入聚乙二醇，加入后的聚乙二醇在洗脱液中的质量百分 比浓度为2-6%，搅拌0. 5-1. 5小时，过滤；
[0010] 5)在上述的滤液中加入Tween80,加入后的Tween80在上述滤液中的质量百分比 浓度为1. 〇%，再加入磷酸三丁酯，加入后的磷酸三丁酯在上述滤液中的质量百分比浓度为 0. 3%，搅匀后升温至24-26°C，后保温6~7小时；
[0011] 6)然后降温至5-15°C，用第一稀释液稀释至电导率不高于15mS/cm，所述的第一 稀释液为〇. OlM Na-citrate溶液，所述的第一稀释液的PH6. 2-7. 20,然后上阴离子交换 柱，所述的阴离子交换柱预先用平衡缓冲液充分平衡，所述的平衡缓冲液由Na-citrate 和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0. 005M-0. 015M、NaCL的浓度为 0. 1M-0. 15M，所述的平衡缓冲液的PH为6. 20-7. 20 ;再用洗涤缓冲液洗涤，所述的洗涤缓冲 液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0. 005M-0. 015M、 NaCL的浓度为0. 18-0. 3M，所述的洗涤缓冲液的PH为6. 20-7. 20,再用洗脱缓冲液洗脱，所 述的洗脱缓冲液由Na-citrate、Arginine Hydrochloride和NaCL组成，在所述的缓冲液 中，Na-citrate 的浓度为 0? 005M-0. 015M、Arginine Hydrochloride 的浓度为 0? 02M、NaCL 的浓度为〇. 5M-1. 0M，所述的洗脱缓冲液的PH为6. 80-7. 80,收集洗脱液即为纯化的凝血因 子IX溶液；
[0012] 7)用第二稀释液稀释步骤6)的洗脱液至电导率不高于15mS/cm，所述的第二稀释 液由Na-citrate、Arginine Hydrochloride组成，在所述的稀释液中，Na-citrate的浓度 为 0. 01M、Arginine Hydrochloride 的浓度为 0. 02M，所述的第二稀释液的 PH为 6. 50-7. 50， 然后上肝素亲和柱，所述的肝素亲和柱预先用平衡缓冲液充分平衡，所述的平衡缓冲液 由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0. 01M-0. 02M、 NaCL的浓度为0. 1M-0. 15M，所述的平衡缓冲液为PH6. 50-7. 50 ;再用洗涤缓冲液洗涤，所 述的洗涤缓冲液由Na-citrate和NaCL组成，在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为 0. 01M-0. 02M、NaCL的浓度为0. 18-0. 25M，所述的洗涤缓冲液的PH为6. 50-7. 50 ;再用洗 脱缓冲液洗脱，所述的洗脱缓冲液由Na-citrate、Arginine Hydrochloride、和NaCL组成， 在所述的缓冲液中，Na-citrate的浓度为0. 01M-0. 02M、Arginine Hydrochloride的浓度 为0. 02M、NaCL的浓度为0. 4M-1. 0M，所述的洗脱缓冲液的PH为6. 50-7. 50,收集洗脱液，用 0. 45 y m或0. 22 y m滤芯过滤以上洗脱液，所得滤液即为高纯凝血因子IX溶液；
[0013] 8)用IOk分子量的超滤膜浓缩以上滤液，然后恒体积透析，再浓缩至凝血因子IX 活力高于35IU/ml，得到凝血因子IX浓缩液；
[0014] 9)调节人凝血因子IX含量至20-30IU/ml，然后调PH值至6. 50-7. 50,并加入肝素 钠至0. 1-0. 4IU/单位FIX，加入盐酸精氨酸和甘氨酸，所述的盐酸精氨酸在凝血因子IX浓 缩液中的质量百分比浓度为〇. 5-3%，所述的甘氨酸在凝血因子IX浓缩液中的质量百分比 浓度为0.5-3%;
[0015] 10)用20纳米滤芯进行除病毒过滤；
[0016] 11)用0. 22ym滤芯对广品进彳丁除囷过滤并分装；
[0017] 12)冻干；
[0018] 13)在KKTC沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活，得到高纯人凝血因子IX。
[0019] 进一步的，步骤6)中，所述的阴离子交换柱为Capto-Q、Q-Sepharose FF、 Q-Sepharose4FF、Q-Sepharose HP、Q_Sepharose XL、DEAE_Sepharose FF、或者 Capto-DEAE 层析柱。
[0020] 进一步的，所述的上肝素亲和柱为 Heparin Sepharose 6FF、Heparin Sepharose CL-6B〇
[0021] 本发明采用经典的DEAE S印hadex A-50凝胶吸附，获得富含凝血因子FIX的粗 品，该凝胶吸附为批处理，对血浆的澄清度无特殊要求，无需过滤，故处理时间短，同时该工 序操作简单，凝血因子IX损失少；本发明获取FIX粗品后，加入PEG沉淀剂，使杂蛋白从凝 血因子IX溶液中沉降、过滤，除掉大部分杂蛋白；同时，PEG也是蛋白保护剂，在接下来的 S/D病毒灭活工序可防止凝血因子IX变性失活；本发明选用Capto-Q新型高效强阴离子填 料，分辨率高，压降小，流速快，比传统填料可节省很多操作时间；由此获得纯化的凝血因子 IX ;本发明选用Ifeparin S印harose 6FF亲和填料，对纯化的FIX进一步精制，获得最高达 153IU/mg的比活；本发明在凝胶吸附及后续的两步柱层析操作中，在洗脱缓冲液中均加入 了蛋白保护剂精氨酸盐酸盐，中间的超滤透析操作中也加入了精氨酸盐酸盐，大大降低了 FIX制品凝血酶激活的概率，提高了产品的合格率；本发明的生产流程中共使用了 S/D病毒 灭活、20纳米膜过滤去病毒及干热病毒灭活病三重灭除病毒措施，对脂包膜病毒、非脂包膜 病毒及细小病毒进行了有效灭除，极大提高了产品的使用安全性。
[0022] 本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的一种从去冷胶血浆中制 备冻干人凝血因子FIX的方法，该工艺流程简洁，操作方便，易于实现工业化，且该