CTTTAAGTTTCAGCCTTGCG ACCATACTCCCCCCGGAACCCAAAAACTTGGCTTTCGCTGAAATGCCGAATGGGTCAATATAAAATATAACACCATC CGATCCTTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCTT GATTAATGAAAACATCCTTGACAAATGCTTTCGCAGAAGTTAGTCTTCAATAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAA TTGAATACTAATGTCCCCAACTATCCCTATTCATCATTACTTTGGCTTTAGAAACCAACGAAATAAGGCCAAAGTCC TATTTCATTATTCCATGCTAATATGTTCAGGCTTGAAAGCCTGCTTTAAACACTCCAATTTTTTCAAAGTAAAAGTT CTGGTTCACCAGCCGCCACCGAAATGACGACTGGCTAACCCAGAAGGTGGAGCCCCGCCCGTTGAGGTACCGATCAA TGAAGACCGAACCCCACAGGCGAAGGCCAAAATTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTAT TGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTACT CATTCCAATTACAAGACCCGTAAAGGCCCTGTATTGTTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAAT TTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCG TTACCCGTTAAAAGCATGGTAGGCCACTAACCTACCATCGAAACTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGCATCATCGCC GGCACAAGGCCATGCGATTCGATTAATTATTATGAATCACCATACAAGCGGTTGCCCGCGTTGGCTTTTTATCTAAT AAGTGCACCTCTTCCAGAAGTCGAGGTTATGTACGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCAAGTAGTAA GTGAATATCAAATAAATTATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACTGTATAAATTTGTT(SEQ ID NO： 6) 〇
[0053] 所得的18s rRNA测序序列在GenBank中采用Blastn进行相似性分析，从核酸序 列数据库中找到与其序列相似度最高的菌株为Umbelopsis isabellina(AF157166)，相似 性达99%。
[0054] 通过对菌株的系统发育分析，发现分尚的菌株在系统进化关系上与Umbelopsis isabellina等在同一个分支，所得18s rRNA序列进化树如图3所示。
[0055] 综合菌株形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，可以确定该菌株为Umbelopsis属 真菌，分子生物学鉴定结果表明其亲缘关系与Umbelopsis isabellina最近，但是通过形 态鉴定可以发现其分生孢子和产孢器形态结构和大小都与Umbelopsis isabellina有差 异，可能为Umbelopsis isabellina的一个新的变种，我们将该菌株暂定为Umbelopsis sp.QZ042。
[0056] 实施例2 :海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp. )QZ042活性物质的提取
[0057] 1?种子培养
[0058] 培养基：马铃薯180~220g，葡萄糖18~22g，琼脂20g，50%人工海水1000mL。 挑取真菌菌丝接种于培养基上进行斜面培养，28°C培养5~7天。其中，人工海水（盐 度3. 34% )的配方如下：每升水含：氯化钠NaCl 26. 726g，氯化镁MgCl22. 26g，硫酸镁 MgS043 . 248g，氯化钙 CaCl2l. 153g，碳酸氢钠 NaHC030. 198g，氯化钾 KCI 0. 721g，溴化钠 NaBr 0? 058g，硼酸 H3B030 . 0 58g，硅酸钠 Na2Si030. 0024g，硅酸钠 Na2Si4090. 0015g，磷酸 H3P040 . 00 2g，六氯化二铝 A12C160. 013g，，氨 NH30. 002g，硝酸锂 LiN030. 0013g。
[0059] 2?发酵培养
[0060] 发酵培养基：马铃薯180~220g，葡萄糖18~22g，50%人工海水1000mL。人工 海水（盐度3. 34% )的配方同上。将斜面培养好的真菌挑到发酵培养基，于25~32°C条 件下以140r/min的转速摇床培养5~7天（或采用静置培养15~30天）。
[0061] 3.将上述发酵液用4层纱布过滤，分别收集菌丝体和发酵液；
[0062] 4?培养物的菌丝体提取物的制备
[0063] 将收集的菌丝体用水冲洗，去除发酵液，干燥；然后用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸 (体积比为80 :15 :5)组成的混合溶剂浸提，浸提的温度为0~8°C，时间为4d，过滤，浸提 液用旋转蒸发器RE-3000在55°C以50r/min的转速下旋转蒸发浓缩至小体积，70°C水浴挥 干溶剂，得到海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物（以下简称 菌丝体提取物），备用。
[0064] 实施例3 :海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp. )QZ042的培养物的菌丝体提取物的 抗菌活性
[0065] 1.指示菌的制备
[0066] 将 E. Coli、B. cereus、Arthrobacter nicotianae、Klebsiella peneumoniae、 Vibrio parahaemolyticus分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37°C摇床上以150r/ min 的车专速培养过夜。指不真菌 Eurotium rubrum、Alternaria sp.、Lasiodiplodia pseudotheobromae、Diaporthe phaseolorum、Pestalotiopsis microspora分别接种于PDA 平板上培养至培养皿的1/2。这些细菌和真菌均由本实验室保存。每株指示菌接2个平板。
[0067] 2.抗细菌活性的测定
[0068] 分别称取实施例2制得的菌丝体提取物，通过加入无菌水稀释溶液到400 y g/ml、 200 y g/ml、100 y g/ml、50 y g/ml、25 y g/ml、12. 5 y g/ml、6. 25 y g/ml,米用平板滤纸片琼 脂扩散法测定其抗菌活性。在培养皿中分别移入500 y L的指示菌悬液，倒入已融化至45°C 的牛肉膏蛋白胨培养基，立即混合均匀。待凝固后，将吸有待测液的5~6cm无菌滤纸片待 浸提液挥发干后，贴于平板上。在26°C培养8~10h后，用十字交叉法测量抑菌直径的大 小，并记录。用空白无菌滤纸吸取浸提液挥发干后，作为空白对照。结果如下述表1所示：
[0069] 表1 :海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp.) QZ042的培养物的菌丝体提取物（50 y g/ ml)的抗细菌活性
[0070]
[0071] 注1: I :对照溶剂乙酸乙酯：甲醇：乙酸（80 :15 :5) ; II :菌丝体提取物（50 yg/ ml)。注 2:抑菌圈（d)大小：： + :(d)〈10.0mm;++:10.0mm〈d〈20.0mm;+++:d>20.0mm;-:无 活性。
[0072] 3.抗真菌活性的检测
[0073] 分别称取实施例2制得的菌丝体提取物，通过加入无菌水稀释溶液到400 y g/ml、 200 y g/ml、100 y g/ml、50 y g/ml、25 y g/ml、12. 5 y g/ml、6. 25 y g/ml,米用打孔法检测待 测液的抗真菌活性。用直径5mm的打孔器，在培养了2-4d的指示真菌的菌落边缘打孔。然 后吸取40uL的待测液于孔内，26°C培养2d后，观察抑菌结果。吸取浸提液作为空白对照。 实验重复三次。结果如下述表2所示：
[0074] 表2:海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp. ) QZ042的培养物的菌丝体提取物 (lOOμg/ml)的抗真菌活性
[0075]
[0076]
[0077] 注1:I :对照溶剂乙酸乙酯：甲醇：乙酸（70~80:15~20:4~8) ;11:菌丝体提 取物（100 y g/ml)。
[0078]注2 :+ :有抗菌活性；-:无抗菌活性。
【主权项】
1. 海洋真菌伞枝霉菌株培养物的菌丝体提取物在制备抗散囊菌、链格孢霉、毛双孢霉 或茎溃疡病菌药物中的应用；其中，所述的海洋真菌伞枝霉菌株培养物的菌丝体提取物按 以下方法进行制备： 1) 种子培养：挑取保藏编号为CGMCCNo. 8101的海洋真菌伞枝霉（Umbelopsissp.) QZ042菌丝接种于PDA固体培养基上斜面培养5~7天，温度控制在26~30°C; 2) 发酵培养：将斜面培养好的真菌接种于液体培养基上，于25~32°C条件下摇床 培养5~7天或静置培养15~30天，得到发酵培养物； 3) 过滤：将发酵培养物过滤，分离出菌丝体和发酵液； 4) 提取：取菌丝体用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸组成的混合溶剂进行浸提，浸提液浓缩， 即得；其中组成混合溶剂的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的体积比为70~80:15~20:4~8。2. -种抗散囊菌、链格孢霉、毛双孢霉或茎溃疡病菌的药物，其特征在于：该药物包含 海洋真菌伞枝霉菌株培养物的菌丝体提取物作为活性成分；其中，所述的海洋真菌伞枝霉 菌株培养物的菌丝体提取物按以下方法进行制备： 1) 种子培养：挑取保藏编号为CGMCCNo. 8101的海洋真菌伞枝霉（Umbelopsissp.) QZ042菌丝接种于PDA固体培养基上斜面培养5~7天，温度控制在26~30°C; 2) 发酵培养：将斜面培养好的真菌接种于液体培养基上，于25~32°C条件下摇床 培养5~7天或静置培养15~30天，得到发酵培养物； 3) 过滤：将发酵培养物过滤，分离出菌丝体和发酵液； 4) 提取：取菌丝体用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸组成的混合溶剂进行浸提，浸提液浓缩， 即得；其中组成混合溶剂的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的体积比为70~80:15~20:4~8。
【专利摘要】本发明公开了一种海洋真菌伞枝霉菌株培养物的菌丝体提取物在制备抗真菌药物中的应用其中所述的海洋真菌伞枝霉菌株培养物的菌丝体提取物按以下方法进行制备：1)挑取保藏编号为CGMCC？No.8101的海洋真菌伞枝霉(Umbelopsis？sp.)QZ042菌丝接种于PDA固体培养基上斜面培养；2)将斜面培养好的真菌接种于PD液体培养基上培养天，得到发酵培养物；3)将发酵培养物过滤，分离出菌丝体和发酵液；4)取菌丝体用混合溶剂进行浸提，浸提液浓缩，即得。申请人经过实验发现，上述菌丝体提取物对散囊菌、链格孢霉、毛双孢霉和茎溃疡病菌等真菌具有明显的抑菌作用。CGMCC No.810120130819
【IPC分类】A61P31/10, A61K36/06
【公开号】CN105168265
【申请号】
【发明人】龚斌, 义翠花, 张艳秋, 方怀义, 庞庭才, 张虹, 董庆亮, 黄鹄
【申请人】钦州学院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2014年5月15日