一种海洋真菌伞枝霉菌株培养物的菌丝体提取物在制备抗真菌药物中的应用
【专利说明】一种海洋真菌伞枝霉菌株培养物的菌丝体提取物在制备抗 真菌药物中的应用
[0001] 本申请是"一种海洋真菌伞枝霉菌株及其菌丝体提取物和应用"的分案申请，原申 请的申请日为：2014年5月15日，申请号为=201410203253. 9,发明名称为：一种海洋真菌 伞枝霉菌株及其菌丝体提取物和应用。
技术领域
[0002] 本发明涉及海洋微生物菌种，具体涉及一种海洋真菌伞枝霉菌株及其菌丝体提取 物和应用。
【背景技术】
[0003] 病原细菌和真菌可引起动植物的多种病害，其不仅影响农作物产量和经济动物生 长生产，造成极大的经济损失；而且影响人体健康，威胁人类生命安全。为了抑制和消灭病 原细菌和真菌，人们一直致力于从不同环境中寻找新的有效的抗菌药物，以缓解越来越严 重的耐药性菌株的出现。
[0004] 在抗真菌药物的研究上，1939年来自青霉菌（Penillicilium griseofulvum)菌 体的灰黄霉素（Griseofulvin)成为发现的第一个抗真菌抗生素，1955年第一个抗真菌药 物两性霉素问世，以后又陆续开发了氟胞嘧啶和唑类等抗真菌药物。但是目前抗真菌药物 仍然存在种类缺乏、选择性小、毒副作用大和耐药性强的缺点，因此研究和开发新型、高效、 低毒、广谱的抗真菌药物十分必要。
[0005] 在抗细菌药物的研究上，从第一个抗菌药物青霉素的出现，到后来的四环素、氯霉 素、卡那霉素、利福平等抗生素，都在人类对抗病原细菌上发挥了较重要作用，但随着抗生 素的烂用。越来越多的多耐药性病原菌开始出现，这是人类面临的又一挑战，挖掘新的抗菌 药物和新的抗菌机制，是人类解决这一问题的有效方法之一。
[0006] 在当今陆地生物资源越来越枯竭的背景下，从海洋微生物中寻找新型的药物是一 条非常有前景的途径。其中2010年1月到2013年2月，就从海洋细菌、真菌、放线菌中发现 895个新的具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤和抗污损的天然活性物质（赵成英，朱统汉，朱 伟明，2010-2013之海洋微生物新天然产物，有机化学，2012, 32, 1-41)。海洋微生物产品 开发上最为成功的例子是1945年从海洋污泥中分离到顶头孢霉菌，从中发现了头孢菌素， 以后发展成系列的头孢类抗菌素。而且有证据表明，原来被认为是来源于海绵等海洋生物 的重要活性物质，如海豚毒素、海葵毒素、麻壳鱼毒素等，实际上也是由微生物产生，这些都 使利用海洋微生物开发新型药物成为了焦点。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种海洋真菌伞枝霉菌株及其菌丝体提取物和 应用。
[0008] 本发明所述的海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp.) QZ042,该菌株已于2013年8月 19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号中国北京中科院微生物研究所），其保藏编号为CGMCC No. 8101。
[0009] 本发明所述的海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp. )QZ042是从海洋腐木中分离、纯 化得到。其分离纯化方法为：取海洋腐木样品，用无菌玻棒捣碎后加入一定量的无菌生理盐 水，再加入玻璃珠在摇床上震荡20~30min (通常在20~30°C条件下进行），静置分层后 取上层液做10倍梯度稀释，取原倍液、10倍和100倍稀释液图布PDA固体平板，26~30°C 恒温培养，等菌落长出后，挑取菌落划线纯化得到。
[0010] 本发明所述的海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp. )QZ042的特征为产孢子，在海水 PDA培养基上生长良好，菌落初期为棕色，后期颜色逐渐变浅，呈轮纹状向外生长，菌落边缘 轮廓清晰，菌落生长较慢，薄而平坦，紧贴培养基，不易挑取，有较多厚垣孢子，有孢囊孢子 和孢子囊；分生孢子为球型，表面带有明显的小突起，球体直径大小约为18~22um ;孢子囊 为球型，球体直径大小约为54~60um。
[0011] 根据常规方法提取该菌株的DNA，利用真菌的ITS区的通用引物ITS1 : 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' 和 ITS4 :5' -TCCTCCGCTTAITGATATGC-3' 扩增其 ITS 区，所得 ITS测序序列如下所示：
[0012] CAGTGGGAAGTAAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCAAAAG ATAATCTTTCAACTCGAAAGATTTTTTCCTTTGTGCTGGCTTTGACCGTATGTAATTTTGGGACTTAAACATGGC AGCCTTTATGGTTTGCCGGTCCCAAAAACAATATATCATCCTTATGAAAAACTTACTGAACAACTAAACAATGAT TTTAATAATCTGTTTAAAACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATG CGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCACTCCTTGGTATTCCG AGGAGTATGCCTGTTTCAGTATCATGAGCACTCTCACTCCTAACCTTTGTGGTTATGATGTGGAATTGGGATGCG CCGATTTTTACTAGTCGGCACTCCTAAAATGTAGCTCTTGGCTGTTTCCTACTACAGCAGTTTGGCCTAATAGTT TTGACTTTTGTCAAATCTTTGGCTCCATTTGCTTCTGGAAGTCAGTCTTGATAATACAGAAAACTCATTCAAACT TGATCTAAATCAGGAGTTC 〇
[0013] 根据常规方法提取该菌株的DNA，利用通用引物5' -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'和 NS4 :5'-CTTCCGTCAAITCCTTTAAG-3'扩增真菌 18s rRNA 基因，所得 18s rRNA 测序序列如下 所示：
[0014] ACTTCTCGTCGGAACCGACTGTTGCCAATCAGTTTCCAACAATCCAAAGGACTCACTAAGCCGTTCAAT CGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGCGAGCTGATGACTCACGCTTACTAGGAA TTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGATG AAGTTTCAAAAGATTACCCAGACCTTCC GGCCAAGGTTATAAACTCGTTGACTTCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCT GTTATTGCCTCAAACTTCCATCAATTAAACATTGATAGTCTCTCTAAGAAGCCAAAAAGACACGACCAAAGTCATGC TGGCTATTTAGCAGAGTAAGGTCTCGTTCGTTATCGGAATTAACCAGACAAATCACTCCACGAACTAAGAACGGCCA TGCACCACCACCCATAGAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTACTATGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCC CGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGC GACCATACTCCCCCCGGAACCCAAAAACTTGGCTTTCGCTGAAATGCCGAATGGGTCAATATAAAATATAACACCAT CCGATCCTTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCT TGATTAATGAAAACATCCTTGACAAATGCTTTCGCAGAAGTTAGTCTTCAATAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACA ATTGAATACTAATGTCCCCAACTATCCCTATTCATCATTACTTTGGCTTTAGAAACCAACGAAATAAGGCCAAAGTC CTATTTCATTATTCCATGCTAATATGTTCAGGCTTGAAAGCCTGCTTTAAACACTCCAATTTTTTCAAAGTAAAAGT TCTGGTTCACCAGCCGCCACCGAAATGACGACTGGCTAACCCAGAAGGTGGAGCCCCGCCCGTTGAGGTACCGATCA ATGAAGACCGAACCCCACAGGCGAAGGCCAAAATTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTA TTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTAC TCATTCCAATTACAAGACCCGTAAAGGCCCTGTATTGTTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAA TTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCC GTTACCCGTTAAAAGCATGGTAGGCCACTAACCTACCATCGAAACTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGCATCATCGC CGGCACAAGGCCATGCGATTCGATTAATTATTATGAATCACCATACAAGCGGTTGCCCGCGTTGGCTTTTTATCTAA TAAGTGCACCTCTTCCAGAAGTCGAGGTTATGTACGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCAAGTAGTA AGTGAATATCAAATAAATTATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACTGTATAAATTTGTTo
[0015] 综合上述形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，可以确定该菌株为Umbelopsis属 真菌，分子生物学鉴定结果表明其亲缘关系与Umbelopsis isabellina最近，但是通过形 态鉴定可以发现其分生孢子和产孢器形态结构和大小都与Umbelopsis isabellina有差 异，可能为Umbelopsis isabellina的一个新的变种，我们将该菌株暂定为Umbelopsis sp.QZ042。
[0016] 本发明的第二个目的在于提供上述海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp. )QZ042培养 物的菌丝体提取物，该提取物是以上述海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp.)QZ042作为发酵 菌株，液体发酵获得发酵培养物，分离菌丝体和发酵液，取菌丝体用由乙酸乙酯、甲醇和乙 酸组成的混合溶剂进行浸提，浸提液浓缩，即得。其中，所述组成混合溶剂的乙酸乙酯、甲醇 和乙酸的体积比优选为70~80:15~20:4~8,进一步优选为75~80:15~18:5~8 ; 所述的液体发酵是将海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp. )QZ042菌株接种到液体培养基 中，于25~32°C条件下摇床培养5~7天或静置培养15~30天，以获得发酵培养物；在 摇床培养时，转速优选为130~150r/min。
[0017] 本发明的第三个目的在于提供上述海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp. )QZ042培养 物的菌丝体提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0018] 1)种子培养：挑取海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp. ) QZ042菌丝接种于PDA固