体 培养基上斜面培养5~7天，温度控制在26~30°C ;
[0019] 2)发酵培养：将斜面培养好的真菌接种于液体培养基上，于25~32°C条件下 摇床培养5~7天或静置培养15~30天，得到发酵培养物；
[0020] 3)过滤：将发酵培养物过滤，分离出菌丝体和发酵液；
[0021] 4)提取：取菌丝体用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸组成的混合溶剂进行浸提，浸提液 浓缩，即得到海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取物。
[0022] 上述方法的步骤2)中，摇床培养时，转速优选为130~150r/min ;步骤4)中，所 述组成混合溶剂的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的体积比优选为70~80:15~20:4~8,浸提的 温度优选为〇~8°C，浸提的时间优选为3~4天。
[0023] 申请人通过实验发现，本发明所述的海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp. )QZ042培 养物的菌丝体提取物在50 y g/ml时，对大肠杆菌（E. Coli)、蜡状芽孢杆菌（B. cereus)、烟 草节杆菌（Arthrobacter nicotianae)、克雷伯氏杆菌（Klebsiella peneumoniae)、副溶血 弧菌（Vibrio parahaemolyticus)等细菌的抑制圈直径 d 分别为 12. 3mm、14.7mm、17. 2mm、 13. 4mm和22. 5mm，表明海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp. )QZ042培养物的菌丝体提取物对 细菌具有抗细菌活性，可以用来制备抗细菌药物。
[0024] 因此，本发明的第四个目的在于提供上述海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp.) QZ042培养物的菌丝体提取物在制备抗大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、烟草节杆菌、克雷伯氏杆 菌或副溶血弧菌药物中的应用。
[0025] 本发明的第五个目的则在于提供一种抗大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、烟草节杆菌、 克雷伯氏杆菌或副溶血弧菌的药物，该药物包含上述海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp.) QZ042培养物的菌丝体提取物作为活性成分。
[0026] 申请人通过实验发现，本发明所述的海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp.) QZ042培养物的菌丝体提取物在lOOμg/ml时，对散囊菌（Eurotium rubrum)、链格孢 霉（Alternaria sp.)、毛双抱霉（Lasiodiplodia pseudotheobromae)、莖溃疡病菌 (Diaporthe phaseolorum)等真菌具有明显的抑菌作用，表明海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp. )QZ042培养物的菌丝体提取物对真菌具有抗真菌活性，可以用来制备抗真菌药物。
[0027]因此，本发明的第六个目的在于提供上述海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp.) QZ042培养物的菌丝体提取物在制备抗散囊菌、链格孢霉、毛双孢霉或茎溃疡病菌药物中的 应用。
[0028] 本发明的第七个目的则在于提供一种抗散囊菌、链格孢霉、毛双孢霉或茎溃疡病 菌的药物，该药物包含上述海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp.)QZ042培养物的菌丝体提取 物作为活性成分。
[0029] 本申请中，所述的液体培养基的组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、50%人工海 水1000mL;所述的PDA固体培养基的组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、50%人工 海水 1000mL。
[0030] 与现有技术相比，本发明提供了一种新的海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp.) QZ042菌株，申请人发现该菌株培养物的菌丝体提取物具有广谱的抗细菌、抗真菌活性，其 活性物质和抑菌机制可能不同于已有的抗菌药物，存在新药研发的潜力。
【附图说明】
[0031] 本发明所涉及的海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp. )QZ042,已于2013年8月19日 保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号中国北京中科院微生物研究所），其保藏编号为CGMCCNo. 8101。
[0032] 图1为本发明所述海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp. )QZ042菌株在培养基上的形 态，其中，A表示PDA培养基上的菌落照片，B表示在光学显微镜下的孢子照片（放大倍数 10X 10)，C表示电镜下的厚垣孢子，D表示电镜下的孢子囊，E表示电镜下的分生孢子梗和 菌丝；
[0033] 图2为本发明所述海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp. ) QZ042的ITS序列进化树；
[0034] 图3为本发明所述海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp.) QZ042的18s rRNA序列进 化树。
【具体实施方式】
[0035] 下面通过实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
[0036] 实施例1:海洋真菌伞枝霉（Umbelopsis sp. )QZ042的分离和鉴定
[0037] 1?真菌的分离
[0038] 用无菌三角瓶取海洋腐木样品，称取5g，采用无菌玻棒捣碎后加入50ml无菌生理 盐水，加入玻璃珠在摇床上震荡20min，静置分层后取上层液做10倍梯度稀释，取原倍液、 10倍和100倍稀释液图布PDA固体培养基，26~30°C恒温培养，等菌落长出后，挑取菌落划 线纯化得到。
[0039] 2.真菌的培养和形态学观察
[0040] 培养特征观察：将菌种接种于PDA培养基上，26°C恒温培养获得菌落。记录初生 菌丝颜色、菌落颜色变化、表面特征、有无色素产生。
[0041] 制片及镜检：挑取各菌株产孢器及菌丝制成水封片，棉蓝溶液染色，进行镜下观 察，记录菌丝特征及分枝情况、孢子和产孢器结构，并拍照记录。
[0042] 结果：真菌在PDA培养基上生长良好，菌落初期为棕色，后期颜色逐渐变浅，呈轮 纹状向外生长，菌落边缘轮廓清晰，菌落生长较慢，薄而平坦，紧贴培养基，不易挑取，有较 多厚垣孢子，有孢囊孢子和孢子囊，真菌的菌落及孢子如图1所示（a表示PDA培养基上的 菌落照片，b表示在光学显微镜下的孢子照片（放大倍数10 X 10)，c表示电镜下的厚垣孢 子，d表示电镜下的孢子囊，e表示电镜下的分生孢子梗和菌丝）。孢囊孢子、孢子囊、菌丝 的电镜图像见图1，从图1可以看出QZ042的分生孢子为球型，表面带有明显的小突起，球 体直径大小约为18~22um ;孢子囊为球型，球体直径大小约为54~60um。
[0043] 3.真囷总DNA的提取
[0044] 将分离得到的内生真菌接种到ro液体培养基中，于26°C摇瓶培养4d。过滤收集 菌丝体。菌丝体采用液氮冻融2次，灭菌玻璃棒研磨后用USA Omega Bio-Tek公司的"真菌 基因组DNA小量提取试剂盒"提取真菌的基因组。
[0045] 4.真菌的ITS分子鉴定
[0046]用通用引物 ITS1 :5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（SEQ ID N0 :1)和 ITS4: 5'-TCCTCCGCTTAITGATATGC-3'（SEQ ID N0:2)扩增真菌rDNA 的间隔序列（含 ITS1 区、5.8S 区、ITS2 区）序列。PCR 反应条件为：94°C变性 5min，然后 94°C，30s -55°C，40s -72°C， 1. Omin进行35个循环扩增，最后72°C延伸lOmin。将PCR产物纯化后直接送上海生工生物 工程技术服务有限公司，用引物ITS1测序，所得ITS测序序列如下所示：
[0047] CAGTGGGAAGTAAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCAAAAG ATAATCTTTCAACTCGAAAGATTTTTTCCTTTGTGCTGGCTTTGACCGTATGTAATTTTGGGACTTAAACATGGC AGCCTTTATGGTTTGCCGGTCCCAAAAACAATATATCATCCTTATGAAAAACTTACTGAACAACTAAACAATGAT TTTAATAATCTGTTTAAAACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATG CGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCACTCCTTGGTATTCCG AGGAGTATGCCTGTTTCAGTATCATGAGCACTCTCACTCCTAACCTTTGTGGTTATGATGTGGAATTGGGATGCG CCGATTTTTACTAGTCGGCACTCCTAAAATGTAGCTCTTGGCTGTTTCCTACTACAGCAGTTTGGCCTAATAGTT TTGACTTTTGTCAAATCTTTGGCTCCATTTGCTTCTGGAAGTCAGTCTTGATAATACAGAAAACTCATTCAAACT TGATCTAAATCAGGAGTTC(SEQ ID NO ：3)〇
[0048] 所得的ITS测序序列在GenBank中采用Blastn进行相似性分析，从核酸序列数据 库中找到与其相似度最高的菌株为Umbelopsis isabellina(AJ876493.1)，相似性达97%。
[0049] 通过对菌株的系统发育分析，发现分离的菌株系统发育关系非常独特，在系统进 化关系上与Umbelopsis isabellina、Umbelopsis ramanniana等在同一个分支，所得ITS 序列进化树如图2所示。
[0050] 5?海洋腐木真菌的18s rRNA基因分子鉴定
[0051]用引物NS1 :5' -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'（SEQ ID N0 :4)和NS4 : 5'-CTTCCGTCAAirCCITTAAG-3'（SEQ ID N0:5)扩增真菌18s rRNA基因序列。PCR反应条 件为：94°C变性5min，然后94°C，30s - 50°C，40s - 72°C，2min进行35个循环扩增，最后 72°C延伸lOmin。将PCR产物纯化后直接送上海生工生物工程技术服务有限公司，用引物 NS1测序，所得18s rRNA测序序列如下所示：
[0052] ACTTCTCGTCGGAACCGACTGTTGCCAATCAGTTTCCAACAATCCAAAGGACTCACTAAGCCGTTCAAT CGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGCGAGCTGATGACTCACGCTTACTAGGAA TTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGATGAAGTTTCAAAAGATTACCCAGACCTTCCG GCCAAGGTTATAAACTCGTTGACTTCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTG TTATTGCCTCAAACTTCCATCAATTAAACATTGATAGTCTCTCTAAGAAGCCAAAAAGACACGACCAAAGTCATGCT GGCTATTTAGCAGAGTAAGGTCTCGTTCGTTATCGGAATTAACCAGACAAATCACTCCACGAACTAAGAACGGCCAT GCACCACCACCCATAGAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTACTATGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCC GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTC