粒毛盘菌水溶性黑色素slim404在提高免疫方面的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药免疫领域，涉及一种水溶性粒毛盘菌黑色素SUM404,具体涉及该 黑色素在提高免疫和制备提高免疫药物方面的应用。
【背景技术】
[0002] 免疫系统是机体对异种、异体及自身物质所产生的反应，发挥免疫功能的组织系 统。从结构上可将免疫系统分为免疫器官、免疫因子和免疫细胞，从功能上课将免疫系统分 为非特异性免疫和特异性免疫。人体的胚胎发育、疾病发生、衰老等一系列的生命过程与免 疫系统有密切的关系，机体对自身的保护作用依赖于这个完善的免疫系统，健康人体需要 维持一个合理平衡的免疫系统。
[0003] 黑色素一般存在于动植物和微生物体内，其可作为一种免疫调节剂，可增强机体 体液免疫和细胞免疫反应，具有显著的正向免疫调节作用。研究发现鱿鱼墨黑色素对小鼠 机体特异性和非特异性免疫机能具有明显的调节作用，裴氏着色霉黑色素可通过宿主抗体 反应激活体液免疫和细胞反应控制着色芽生菌病，构巢曲霉黑色素具有抗炎作用，其可作 为一种抗炎新药开发。粒毛盘菌是一种腐生性真菌，其在深层发酵条件下可产生具有抑 菌、抗氧化、抗衰老、抗辐射等生物活性的黑色素。粒毛盘菌YM404胞内均一性黑色素分子 结构中含有苯并噻唑和吲哚环，不溶于水及常见有机溶剂，硫酸酯化修饰后，其水溶解度为 2. 06g(30°C)，且具有显著的体外抗氧化活性。目前国内外未见有公开文献提及将粒毛盘菌 黑色素作为制备免疫调节药物的应用方面的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明提供水溶性粒毛盘菌黑色素在提高免疫方面的作用，通过该黑色素制备提 高免疫药物的应用，弥补当前研究的空白。
[0005]本发明的目的通过以下技术方案实现
[0006]本发明提供一种水溶性粒毛盘菌黑色素SUM404,该黑色素是粒毛盘菌YM404胞 内黑色素，经三氧化硫-吡啶修饰后得到的水溶性粒毛盘菌黑色素，具有提高免疫功能的 作用。
[0007]本发明还提供了上述水溶性粒毛盘菌黑色素SUM404在提高免疫功能方面的应 用，其中：
[0008] 水溶性粒毛盘菌黑色素SUM404提高免疫通过促进胸腺器官发育实现。
[0009] 或者，水溶性粒毛盘菌黑色素SUM404提高免疫通过提高巨噬细胞的吞噬百分率 和吞噬指数实现。
[0010]或者，水溶性粒毛盘菌黑色素SUM404提高免疫通过增强B细胞介导的体液免疫 实现。
[0011]或者，水溶性粒毛盘菌黑色素SUM404提高免疫通过促进T细胞介导的免疫应答 反应实现。
[0012] 或者，水溶性粒毛盘菌黑色素SUM404提高免疫通过提高体内抗氧化酶系统的活 性，清除免疫低下机体内过量的自由基和脂质过氧化物实现。
[0013] 本发明还提供了一种药物，该药物包括水溶性粒毛盘菌黑色素SUM404。
[0014] 本发明还提供了上述药物在提高免疫功能方面的应用，该药物中水溶性粒毛盘菌 黑色素SUM404质量占药物总质量的35%以上。
[0015] 有益效果：
[0016] 本发明通过大量试验，证实粒毛盘菌YM404胞内黑色素经三氧化硫-吡啶修饰后 得到的水溶性粒毛盘菌黑色素SUM404可以通过多种途径达到提高免疫的作用，创造性地 提出以该黑色素为基础生产提高免疫药物，该种药物可以以多种形式给药，并且无毒、易 得、稳定，是一种优良的提高免疫药物。同时，以粒毛盘菌发酵生产，为大规模生产该黑色素 SUM404及相关产品提供可能，不产生污染，能产生较好的规模效益。
【附图说明】
[0017] 图1为非水溶性原粒毛盘菌（Lachnum)YM404胞内黑色素的红外光谱图；
[0018] 图2为本发明的采用三氧化硫-吡啶对粒毛盘菌（Lachnum)YM404胞内黑色素进 行修饰改性后的水溶性黑色素的红外光谱图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件。
[0020] 实施例1
[0021] 一、粒毛盘菌胞内黑色素（UM)的制备：
[0022] 将粒毛盘菌YM404 (该菌株编号来源于文献Purification, structure and anti-radiation activity of melanin from Lachnum YM404. International journal of biological macromolecules，2014, 63:170-176?期刊 ISSN:0141_8130)接种于 100L 发酵 罐，培养基配方为：酪氨酸浓度为1. 〇mm〇l/L，铜离子浓度为1. lmmol/L，蔗糖质量为25. 5g/ L，酵母膏5. 0g/L，蛋白胨5. 0g/L，pH 8. 0,装料系数体积比为0. 7,接种量为5% (v/v)，培养 温度为27°C，通气量为1. 0L/min，搅拌转速为180r/min，发酵时间为12d ;将发酵液抽滤，收 集菌丝体，60°C烘干，按菌丝体的质量（g)与浓度为lmol/L的氢氧化钠（mL)比为1:100混 匀，30°C静置12h，抽滤得浸提液；向上述浸提液加入lmol/LHCl调节pH为1~2,静置12h 后将上述悬浮液离心，所得到的沉淀经去离子水洗涤至pH为7后，真空冷冻干燥，即得黑色 素粗品；再将该黑色素粗品加入7mol/L HC1后于KKTC酸解2h，除去与黑色素结合的蛋白 质及碳水化合物。酸解后，抽滤得沉淀，沉淀经双蒸水洗涤至上清液pH值为7时重新溶于 lmol/L NH3 ? H20溶液，旋转蒸发仪蒸去NH3至溶液pH为中性后，依次经乙酸乙酯、氯仿、无 水乙醇萃取，以除去脂类物质，萃取后旋转蒸发除去有机相，水相调pH值为2,以5000r/min 离心10min，分离得到的沉淀经去离子水反复洗涤至上清液Cr定性检测为阴性后，真空冷 冻干燥，即得到粒毛盘菌YM404胞内黑色素（UM)。
[0023] 二、水溶性粒毛盘菌黑色素（SUM404)的制备
[0024] 将90mL吡啶加入附有冷凝管、温度计的250mL三颈瓶中，用电磁加热搅拌器搅拌， 同时缓慢加入三氧化硫-吡啶2-3. Og。加热至90°C，再加入通过上述方法得到的UM404粉 末0. 5g，恒温搅拌lh，冷却至室温。反应液用3mol ? L-1的NaOH溶液调至中性，静置24h。 自来水和蒸馏水分别透析2d，过滤，冷冻干燥，得硫酸酯化黑色素SUM404。
[0025] 三、水溶性粒毛盘菌黑色素（SUM404)的结构验证
[0026] 取上述粒毛盘菌胞内黑色素UM404和水溶性黑色素SUM404各2mg，分别与 400mg干燥的KBr混匀、压片，采用FT-IR 6700傅立叶变换红外光谱仪进行红外光谱分析， 扫描区间为4000-400cm i。图1为非水溶性原粒毛盘菌（Lachnum)YM404胞内黑色素的红 外光谱图，图2为本发明的采用三氧化硫-吡啶对粒毛盘菌（Lachnum)YM404胞内黑色素 进行修饰改性后的水溶性黑色素的红外光谱图。对比分析这两个红外光谱图的结果表明， SUM404红外光谱在1080cm \820cm 1处出现了新的吸收峰（图2)，可能分别为-0-S0 3H中 S = 0的伸缩振动峰、C-0-S伸缩振动吸收峰，表明硫酸酯化修饰成功。
[0027] 四、水溶性粒毛盘菌黑色素（SUM404)的免疫调节作用药理实验：
[0028] (1)粒毛盘菌黑色素生理盐水溶液的制备：将上述两种粒毛盘菌黑色素粉末，用 质量百分浓度为〇. 9%的生理盐水分别配制成50mg/mL和200mg/mL的水溶液，采取的给药 体积为〇. 2mL/只，1次/d，连续3周。
[0029] (2)动物：昆明小鼠90只，雄性，体重20±2g，SPF级，随机分为7组。
[0030] (3)试剂：超氧化物歧化酶（S0D)测试盒、谷胱甘肽过氧化氢酶（GSH-PX)试剂盒、 丙二醛（MDA)试剂盒，为南京建成生物工程研究所生产的产品；绵羊红细胞、鸡血红细胞、 豚鼠血清（规格100mL，上海远慕生物科技有限公司）；环磷酰胺（Cy)(批号20071017,规 格200mgX5瓶），江苏恒瑞制药厂；盐酸左旋咪唑（编号A1420204705,规格25mg*100s)，广 东华南药业集团有限公司；RPMI-1640培养基、印度墨汁、Hanks液体、都氏液，美国Hyclone 公司；四氮唑盐（MTT)、刀豆蛋白（ConA IV)四型，Sigma公司
[0031] (4)方法：昆明小鼠，小鼠适应性喂养1周后，分别称重并记录，随机取出10只 作正常组，用生理盐水0. 2mL/次灌胃，其余开始皮下注射环磷酰胺15mg/kg ? bw，连