号处理，即用70%酒精浸 泡30s+ (50mg/L利福平+50mg/L氯霉素)混合液浸泡30min+0. 1%升汞浸泡8min消毒效果 较好。
[0035] 2. 3成年植株外植体 2. 3. 1叶片 试验表明(表5)，从污染率看，8月份> 12月份>4月份，8月份的叶片带菌多，灭菌困 难。与幼苗叶片相比，成年植株叶片消毒困难，即使是4月份采集的叶片外植体，污染率也 在60%以上，培养基中添加PPM0.5ml/L后灭菌效果仍然很差。4个处理中8号处理效果 较好，添加抗菌剂处理之后，污染率为66. 67%，存活率为33. 33%，诱导率80%，灭菌有效值为 8. 89%。因此，用成年植株叶片为外植体，以4月份采集，用70%酒精浸泡30s+ (50mg/L利 福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0. 1%升萊浸泡12min消毒及诱导效果最好。
[0036] 2. 3. 2 茎段 成年植株茎段外植体消毒处理比其叶片更为困难(表6)，4月份、12月份采集的茎段相 对带菌较少，但污染率低于60%，8月份的带菌最多，无论哪种灭菌处理均全部污染。成年植 株茎段消毒效果以12月份采集材料，用7号处理消毒效果较好，污染率为63. 67%、存活率为 33. 33%，但从诱导率看，以4月份采集材料，在培养基中添加PPMO. 5ml/L(6号处理)效果较 好，诱导率高达100%。从灭菌有效值看，6号处理和7号处理效果都比较差，成年植株无菌 体系建立还有待进一步探索。
[0037] 3.小结与讨论 在植物组织培养过程中，无菌培养体系的建立是获取组培苗的重要环节。以不同生长 阶段的花榈木叶片、茎段作为外植体的消毒试验结果表明，籽苗外植体以70%乙醇消毒30s +0. 1%升汞灭菌8min+70%乙醇消毒30s+培养基中添加PPMO. 5ml/l(4号处理)的消毒效 果最好。幼苗外植体以4月份采集效果较好，幼苗茎段用70%酒精浸泡30s+(50mg/L利福平 +50mg/L氯霉素)混合液浸泡30min+0.l%Hgcl浸泡8min(15号处理)消毒效果最好，幼苗 叶片用70%酒精浸泡30s+ (50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0?l%Hgcl 浸泡6min(14号处理）消毒效果最好。成年植株外植体叶片以4月份采集较好，最佳消毒 方法为：70%酒精浸泡30s+ (50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.l%Hgcl 浸泡12min(8号处理)。
[0038] 外植体消毒的关键之处在于合适消毒方法和消毒时间的选定，合适消毒剂组合的 消毒方法以及合适的消毒时间的确定对植物无菌快繁体系的建立均具有重要作用。判断 某种消毒方法是否合适，要以存活率为主要依据，并综合考察污染率及诱导率。研究发现， 采用抗菌剂（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液及（100mg/L苯菌灵+100mg/L链霉素） 混合液浸泡在花榈木外植体的消毒中均能起到一定的灭菌效果。在培养基中添加低浓度 (0. 5ml/L)的植物组培抗菌剂（PPM)，可以在不影响诱导率的前提下，显著提升外植体的未 污染率和存活率。
[0039] 不同取材部位及取材时间对外植体的消毒难易程度有极大影响。取材时间对多数 植物的组织培养都有一定的影响。研究发现，4月份及12月份取材的消毒效果优于8月份 取材的花榈木外植体，这可能是由于4月份之后温度上升导致菌类活跃性上升。另外，由于 4月份时植物生长较旺盛，因此此时取材的外植体诱导效果更好。同时研究发现，消毒时选 用幼嫩叶片及带顶芽茎段比下部茎段消毒效果更好，因为其生长时间不长，杂菌等附着物 较少，因而灭菌较容易。
【主权项】
1. 一种花榈木组培消毒灭菌配方，其特征在于：包括70%酒精、0. 1%升汞、70%酒精和 向增殖培养基中添加〇. 5ml/L植物组织培养抗菌剂。2. -种花榈木组培消毒灭菌配方，其特征在于：包括70%酒精，50mg/L利福平和50mg/ L氯霉素混合液以及0. 1%的升汞。3. -种花榈木组培消毒灭菌配方，其特征在于：包括70%酒精，50mg/L利福平和50mg/ L氯霉素混合液以及0. 1%的升汞。4. 一种花榈木组培方法，其特征在于：该方法包括以下步骤： (1) 外植体的采集：采用苗龄10天的花榈木籽苗茎段外植体； (2) 清洗：采用洗涤剂浸泡15分钟，用流水冲洗30分钟； (3) 消毒：将步骤（2)中洗净的外植体拿入无菌工作台内，采用权利要求1所述的一种 花榈木组培消毒灭菌配方，依次采用70%酒精、0. 1%升汞和70%酒精浸泡，其浸泡时间分别 为0. 5分钟、8分钟和0. 5分钟，每次消毒处理后均用无菌水冲洗4-5次； (4) 接种：将步骤（3)中清洗后的外植体接种在诱导培养基上，所述诱导培养基包括MS 培养基及附加成分，并向诱导培养基中添加〇. 5ml/L植物组织培养抗菌剂； (5) 培养：将步骤（4)中放置在诱导培养基中的外植体放入到培养箱中进行培养，采用 培养条件为：温度23-27°C，光强2500-30001x，白天光照12小时。5. -种花榈木组培方法，其特征在于：该方法包括以下步骤： (1) 外植体的采集：采用当年生花榈木播种幼苗的带顶芽茎段、带侧芽茎段或叶片外植 体，采集时间为4月份； (2) 清洗：采用洗涤剂浸泡30分钟，用流水冲洗1小时； (3) 消毒：将步骤（2)中洗净的外植体拿入无菌工作台内，采用权利要求2所述的一种 花榈木组培消毒灭菌配方，依次采用70%酒精、50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混合液以及 〇. 1%的升汞浸泡，针对叶片其浸泡时间分别为〇. 5分钟、30分钟和6分钟，针对茎段其浸泡 时间分别为〇. 5分钟、30分钟和8分钟，每次消毒处理后均用无菌水冲洗外植体4-5次； (4) 接种：将步骤（3)中清洗后的外植体接种在诱导培养基上，所述诱导培养基包括MS 培养基及附加成分； (5) 培养：将步骤（4)中放置在诱导培养基中的外植体放入到培养箱中进行培养，采用 培养条件为：温度23-27°C，光强2500-30001x，白天光照12小时。6. -种花榈木组培方法，其特征在于：该方法包括以下步骤： (1) 外植体的采集：采用多年生花榈木成年植株上的当年生叶片，采集时间为4月份； (2) 清洗：采用洗涤剂浸泡1小时，用流水冲洗2小时； (3) 消毒：将步骤（2)中洗净的外植体拿入无菌工作台内，采用权利要求3所述的一种 花榈木组培消毒灭菌配方，依次采用70%酒精、50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混合液以及 〇. 1%升汞的浸泡，其浸泡时间分别为〇. 5分钟、30分钟和12分钟，每次消毒处理后均用无 菌水冲洗外植体4-5次； (4) 接种：将步骤（3)中清洗后的外植体接种在诱导培养基上，所述诱导培养基包括MS 培养基及附加成分； (5) 培养：将步骤（4)中放置在诱导培养基中的外植体放入到培养箱中进行培养，采用 培养条件为：温度23-27°C，光强2500-30001X，白天光照12小时。7.如权利要求4-6任一所述的一种花榈木组培方法，其特征在于：所述MS基本培养基 成分如下： 硝酸钾 KNO3 1900mg/L 硝酸铵 NH4NO3 1650mg/L 七水硫酸镁 MgSO4. 7H20 370mg/L 磷酸二氢钾 KH2PO4 170mg/L 二水氯化钙 CaCl2. 2H20 440mg/L 四水硫酸锰 MnSO4. 4H20 22. 3mg/L 七水硫酸锌 ZnSO4. 7H20 8. 60mg/L 硼酸 H3BO3 6. 20mg/L 碘化钾 KI 0. 83mg/L 二水钼酸钠 NaMoO4. 2H20 0. 25mg/L 五水硫酸铜 CuSO4. 5H20 0. 025mg/L 六水氯化钴 CoCl2. 6H20 0. 025mg/L 乙二胺四乙酸二钠 Na2-EDTA 37. 30mg/L 四水硫酸亚铁 FeSO4. 4H20 27. 80mg/L 甘氨酸 2.00mg/L 盐酸硫胺素 0? 10mg/L 盐酸吡哆醇 0? 50mg/L 烟酸 0? 50mg/L 肌醇 100mg/L ; 所述诱导培养基附加成分为6-BA2.0mg/L，NAA1.0mg/L，琼脂8g/L，蔗糖30g/L。
【专利摘要】本发明公开了一种花榈木组培消毒灭菌配方和组培方法，籽苗茎段以70%乙醇消毒30s+0.1%升汞灭菌8min+70%乙醇消毒30s+植物组织培养抗菌剂0.5ml/L的消毒效果最好；幼苗外植体采集最佳时间为4月份，茎段用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%升汞浸泡8min消毒效果最好，叶片用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%升汞浸泡6min消毒效果最好。成年植株叶片以4月份采集较好，用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%升汞浸泡12min。本发明通过不同的消毒方法对花榈木外植体的籽苗、幼苗和成年植株组培进行消毒，能够获得较好的成活率，并且大大扩展了花榈木组培繁殖材料的来源，针对消毒时间的控制能够大大提高花榈木的组培效果。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105165627
【申请号】
【发明人】韦小丽, 乔栋, 张兰, 安常蓉
【申请人】贵州大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月22日