一种花榈木组培消毒灭菌配方和组培方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种花榈木组培消毒灭菌配方，还涉及 一种花榈木组培方法。
【背景技术】
[0002] 花榈木（Ae/z/yiPrain)是豆科红豆属常绿乔木，又名花梨木、臭桐柴，属 国家二级重点保护植物，高5-13米，奇数羽状复叶，长圆形或长圆倒披针形，四季常绿，无 明显落叶现象；小枝及叶背密生灰黄色短柔毛；花期6-7月，黄白色，总状花絮；荚果扁平， 成熟时呈黑褐色，种子红色。花榈木木材致密、纹理美丽、有光泽、耐腐蚀、易切削、切面光 滑，是珍贵用材树种，又因其树皮青绿光滑，树姿优美成为优质园林绿化树种，适合用作行 道树及庭院栽培；其根、枝、叶还是名贵药材，祛风散结、解毒祛瘀。
[0003]目前花榈木以种子繁殖为主，但由于花榈木种子种皮包被有蜡质层，阻碍种子吸 水发芽，因而自然条件下种子成熟散落后很难自然萌发，人工播种时采用85°c热水对种皮 进行人工处理或进行破皮处理，可以显著提高其发芽率。由于花榈木野生植株稀少，结实困 难且结实率低，种子繁殖系数低。组织培养具有繁殖速度快、繁殖系数大、后代性状整齐的 优点。因而建立花榈木组织培养快繁体系，扩大繁殖系数，对花榈木野生资源的保护和人工 培育具有重要意义。
[0004] 在组织培养过程中，外植体的消毒是极其重要的步骤，选择合适的外植体及适当 的外植体消毒方法是组织培养成功的前提。现有的花榈木组培方法是以花榈木无菌萌发幼 苗为外植体进行，通过花榈木种子消毒后在无菌环境中萌发得到的无菌籽苗作为外植体， 经过增殖、生根等步骤构建组培体系。但由于花榈木种子资源的限制，外植体的获得仍具有 一定的局限性。若花榈木组培初代培养材料取自自然萌发生长的植株，由于其带菌系数很 高，组培过程中外植体污染严重，成活率极低。只有筛选出更有效的消毒方法，才能进行进 一步的组织培养研究。
[0005] 在文献"花榈木的组织培养和快速繁殖(姚军等，植物生理学通讯，200 7，01 : 123-124)"中采用种子无菌萌发获得的带叶茎段进行组织培养和快速繁殖研究，在文献"花 榈木胚轴愈伤组织的诱导及植株再生（高丽等，安徽农业科学，2009,33 :16271-16273)"中 则采用花榈木种子无菌萌发获得的胚轴进行组织培养及后续的耐冷性诱导，两人采用的外 植体均来源于种子无菌萌发的材料，繁殖材料仍然有限。有关花榈木自然萌发植株和成年 植株外植体获得组培成功的案例尚未见报道，其原因是自然萌发植株和成年植株外植体内 生菌多，无菌培养体系建立困难。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是：提供一种花榈木组培消毒灭菌配方和组培方法，旨 在解决花榈木外植体组培中污染严重、成活率极低和难于诱导问题，以克服现有技术问题 的不足。
[0007] 本发明的技术方案：一种花榈木组培消毒灭菌配方，包括70%酒精、0. 1%升汞、70% 酒精和向诱导培养基中添加〇.5ml/L植物组织培养抗菌剂（PPM)。
[0008]-种花榈木组培消毒灭菌配方，包括70%酒精，50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混 合液以及0. 1%的升汞。
[0009] 一种花榈木组培消毒灭菌配方，包括70%酒精，50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混 合液以及0. 1%升汞。
[0010] 一种花榈木组培方法，该方法包括以下步骤： (1) 外植体的采集：采用苗龄10天的花榈木籽苗茎段外植体； (2) 清洗：采用洗涤剂浸泡15分钟，用流水冲洗30分钟； (3) 消毒：将步骤（2)中洗净的外植体拿入无菌工作台内，采用权利要求1所述的一种 花榈木组培消毒灭菌配方，依次采用70%酒精、0. 1%升汞和70%酒精浸泡，其浸泡时间分别 为0. 5分钟、8分钟和0. 5分钟，每次消毒处理后均用无菌水冲洗4-5次； (4) 接种：将步骤（3)中清洗后的外植体接种在诱导培养基上，所述诱导培养基包括MS 培养基及附加成分，并向诱导培养基中添加〇. 5ml/L植物组织培养抗菌剂（PPM); (5) 培养：将步骤（4)中放置在诱导培养基中的外植体放入到培养箱中进行培养，采用 培养条件为：温度23-27°C，光强2500-30001x，白天光照12小时。
[0011] 一种花榈木组培方法，该方法包括以下步骤： (1) 外植体的采集：采用当年生花榈木播种幼苗的带顶芽茎段、带侧芽茎段或叶片外植 体，采集时间为4月份； (2) 清洗：采用洗涤剂浸泡30分钟，用流水冲洗1小时； (3) 消毒：将步骤（2)中洗净的外植体拿入无菌工作台内，采用权利要求1所述的一种 花榈木组培消毒灭菌配方，依次采用70%酒精、50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混合液以及 〇. 1%的升汞浸泡，针对叶片其浸泡时间分别为〇. 5分钟、30分钟和6分钟，针对茎段其浸泡 时间分别为〇. 5分钟、30分钟和8分钟，每次消毒处理后均用无菌水冲洗外植体4-5次； (4) 接种：将步骤（3)中清洗后的外植体接种在诱导培养基上，所述诱导培养基包括MS 培养基及附加成分； (5) 培养：将步骤（4)中放置在诱导培养基中的外植体放入到培养箱中进行培养，采用 培养条件为：温度23-27°C，光强2500-30001x，白天光照12小时。
[0012] -种花榈木组培方法，该方法包括以下步骤： (1) 外植体的采集：采用多年生花榈木成年植株上的当年生叶片，采集时间为4月份； (2) 清洗：采用洗涤剂浸泡1小时，用流水冲洗2小时； (3) 消毒：将步骤（2)中洗净的外植体拿入无菌工作台内，采用权利要求1所述的一种 花榈木组培消毒灭菌配方，依次采用70%酒精、50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混合液以及 〇. 1%升汞的浸泡，其浸泡时间分别为〇. 5分钟、30分钟和12分钟，每次消毒处理后均用无 菌水冲洗外植体4-5次； (4) 接种：将步骤（3)中清洗后的外植体接种在诱导培养基上，所述诱导培养基包括MS 培养基及附加成分； (5) 培养：将步骤（4)中放置在诱导培养基中的外植体放入到培养箱中进行培养，采用 培养条件为：温度23-27°C，光强2500-30001X，白天光照12小时。
[0013] 优选的，上述MS培养基成分如下： 硝酸钾KN03 1 900mg/L 硝酸铵NH4N03 1 6 50mg/L 七水硫酸镁MgS04. 7H20 370mg/L 磷酸二氢钾KH2P04 1 70mg/L 二水氯化钙CaC12. 2H20 440mg/L 四水硫酸锰MnS04. 4H20 22. 3mg/L 七水硫酸锌ZnS04. 7H20 8. 60mg/L 硼酸H3B03 6 . 20mg/L 碘化钾KI 0. 83mg/L 二水钼酸钠NaMo04. 2H20 0. 25mg/L 五水硫酸铜CuS04. 5H20 0. 025mg/L 六水氯化钴CoC12. 6H20 0. 025mg/L 乙二胺四乙酸二钠Na2-EDTA 37. 30mg/L 四水硫酸亚铁FeS04. 4H20 27. 80mg/L 甘氨酸 2.OOmg/L 盐酸硫胺素 0?lOmg/L 盐酸吡哆醇 0? 50mg/L 烟酸 0? 50mg/L 肌醇 lOOmg/L; 上述附加成分为6-BA(6-节胺基噪呤，6-Benzylaminopurine)2.0mg/L，NAA(萘乙 酸，I-Naphthylacetic) 1. 0mg/L，琼脂 8g/L，鹿糖 30g/L。
[0014] 本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明有如下效果： (1)本发明采用70%酒精、0. 1%升汞、70%酒精和向增值培养基中添加0. 5ml/L植物组 织培养抗菌剂（PPM)对籽苗进行消毒，能够大大降低污染率，将污染率控制在6. 67%，从而 大大提高籽苗的组培成活率，达到93. 33%，诱导率达到100%，组培效果显著。
[0015] (2)本发明采用70%酒精浸泡30s+ (50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡 30min+0. 1%升汞浸泡8min对幼苗的茎段进行消毒和和采用70%酒精浸泡30s+(50mg/L利 福平+50mg/L氯霉素)混合液浸泡30min+0. 1%升汞浸泡6min对幼苗的叶片进行消毒，都能 够大大降低污染率，前者和后者将污染率控制在〇,大大提高幼苗外植体的组培成活率，前 者存活率达到33. 3%，后者存活率达到100%，前者诱导率到达60%，后者诱导率到达64. 29%， 组培效果显著。
[0016] (3)本发明采用70%酒精浸泡30s+ (50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡 30min+0. 1%升汞浸泡12min对花榈木成年植株当年生叶片进行消毒，能够大大降低污染率 将污染率控制在66. 67%，从而大大提高成年植株外植体的组培成活率，达到33. 33%，叶片 诱导率达到80%，茎段诱导率达到20%，组培效果较显著。
[0017] (4)本发明采用花榈木外植体的籽苗、幼苗及成年植株叶片进行组培，大大扩展了 组培繁殖材料的来源，有效解决了现有技术中只能采用花榈木种子萌发籽苗进行组培的局 限性，并且也大大提高了组培的存活率和诱导率。由于籽苗外植体及当年生幼苗外植体较 为幼嫩，时间过长会导致外植体死亡，过短会导致消毒效果差，因此，采用本发明中的消毒 浸泡时间能够大大提高消毒效果。
[0018] (5)本发明采用的消毒配方简单，但能够起到很好地消毒作用，在花榈木的组织培 养中根据具体的情况设置浸泡时间和添加植物组织培养抗菌剂，起到了非常好的消毒效果