时固定那些以 前的设置。
[0302] 结果：结果（图14Α)表明，直接稳定性的第3个月的时间点具有84. 52%的活力， 而加速条件具有79. 02%。
[0303] 在第3个月时间点的解冻后的增殖
[0304] 加速稳定性培养条件：在Τ-25烧瓶（n= 3)、ρ= 0. 0991、1Κ接种密度、收获培养 期（第8天）下，进行解冻后的增殖研究。直接稳定性培养条件：在Τ-25烧瓶（η= 3)、 **ρ〈0. 001、1Κ接种下，进行解冻后的增殖研究。对照表示相同批次并且以常规标准程序冷 冻保存的BM-MSC的1百万个细胞小瓶（冷冻小瓶（cryo-vial))的解冻后的增殖。总体结 果表明，与加速条件、收获培养期：第8天相比，解冻后的增殖率和产率在直接稳性中更高。
[0305] 结果：与加速稳定性相比，直接稳定性研究的解冻后的增殖（图14B)已经示出了 更好的活力。
[0306] 加速过程和直接稳定过程的CFU-F测定
[0307] 方案：对于CFU-F测定，将来自直接稳定性研究小瓶和加速稳定性小瓶（每个条件 η = 2)的100个MSC铺板在100mm2的细胞培养皿上。在温育14天之后，用结晶紫染色平 板，并且计数可见克隆。
[0308] 结果：即使在21天时间点，加速条件的CFU-F也不能够示出任何克隆（图14C)。
[0309] 三谱系潜能研究
[0310] 方案：通过用10SM的地塞米松（Sigma-Aldrich)、30μg/mL的抗坏血酸 (Sigma-Aldrich)和 10mM的β-甘油磷酸酯（Sigma-Aldrich)补充细胞 3 周，诱导BM-MSC 的成骨细胞分化。通过VonKossa染色，评估钙累积。将分化的细胞用PBS洗涤并且用10% 的福尔马林固定30分钟。在UV光下，将固定的细胞用5 %的AgN03温育60分钟，并且然后， 用2. 5%的硫代硫酸钠处理5分钟并且捕获图像。
[0311] 方案：为了诱导脂肪形成的分化，用1μΜ的地塞米松、0.5mM的异丁基甲基 黄噪呤、1μg/mL的胰岛素和100μΜ的吲噪美辛（讳甲新，indomethacin)(全部来自 Sigma-Aldrich)补充BM-MSC持续21天。然后，吸取上清液，并且将细胞固定在10%的福 尔马林中持续20分钟。进一步地，添加200μ1的油红0染色溶液，并且在室温下温育10 分钟。将细胞用蒸馏水清洗五次并且捕获图像。
[0312] 方案：为了诱导软骨形成的分化，将直接稳定性和加速稳定性小瓶的BM-MSC培养 在STEMPROdnvitrogen)软骨形成分化培养基（具有软骨形成补充物的软骨细胞分化基础 培养基）中。每隔3天，补充软骨形成分化培养基。为了染色，将细胞用4%的福尔马林固 定30分钟。添加番红0染色溶液并且温育5分钟。将细胞用蒸馏水清洗并且捕获图像。使 用NikonEclipse90i显微镜（NikonCorporation,Japan,www.nikon.com)和Image-Pro Express软件（MediaCybernetics,Inc,SilverSpring，MD，www.mediacy.com),捕获朝向 骨形成、软骨形成和脂肪形成分化的BM-MSC图像。
[0313] 总结：可以观察到的是，在7AAD、CFU-F方面，与加速稳定性相比，直接稳定性研究 示出了更高的活力以及与加速条件相比多谱系分化能力。
[0314] 结果：与加速稳定性相比，直接稳定性研究的解冻后的增殖（图14D)显示为更好。
【主权项】
1. 一种用于培养间质基质细胞的方法，所述方法包括以下动作： a.在包括碱性成纤维细胞生长因子bFGF的培养基存在下，允许培养直至第一预定传 代的所述间质基质细胞扩增至第二预定传代； 其中，当所述细胞实现至少一个预定汇合时，通过使所述细胞与所述培养基接触进行 所述扩增；并且其中，当与所述第一预定传代的细胞数目相比，所述方法在所述第二预定传 代结束时使所述细胞的数目增加了 2000倍。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞数目的增加发生在21天的最大周期中。3. 根据权利要求1所述的方法，其中，通过连续传代，允许所述第一预定传代的细胞扩 增至所述第二预定传代；并且其中，所述第一预定传代范围从传代2次至传代9次；并且， 所述第二预定传代范围从传代5次至传代10次。4. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一预定传代是传代3次；并且，所述第二 预定传代是传代5次。5. 根据权利要求1所述的方法，其中，用于所述扩增的接种的细胞数目范围从约60万 至约70万个细胞；并且，在所述扩增之后获得的细胞数目是至少约18亿个细胞；并且其 中，所述方法使所述细胞的数目增加了至少2000倍。6. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养基的组分是浓度范围从约75%至95% 的Dulbecco改良的Eagle培养基-KnockOut，即，DMEM-KO;浓度范围从约5%至15%的胎牛 血清，即？83;浓度范围从约0.5%至2%的谷氨酰胺；具有约501]/1111至约1001]/1111浓度的青 霉素和约50μg/ml至约100μg/ml浓度的链霉素的青链霉素；以及浓度范围从约0. 5ng/ ml至5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，即bFGF。7. 根据权利要求6所述的方法，其中，以避免体积误差并且提供所述bFGF在所述培养 基的多个等分部分中均匀分布的方式，通过母液混合所述组分的方法制备所述培养基，所 述方法包括以下动作： a. 制备X升包含所述DMEM-KO、FBS、谷氨酰胺和青链霉素，缺乏bFGF的所述培养基，并 且分配在X个1升容器中并且将所述容器从1至X标记； b. 从容器1号中取出Zml的培养基，并且分配到标记号为X+1的新无菌容器中； c. 将预定量的bFGF添加至1升减（-)Zml的容器1号的培养基，并且充分地混合以获 得bFGF母液混合物； d. 从标记为2至X的所述容器的每个中单独地取出等量的培养基，并且将所述Zml的 培养基添加至容器号X+1，从而使得容器号X+1的总培养基体积为Bml;以及 e. 单独地取出预定量的步骤c中获得的bFGF母液混合物，并且在容器2至X中各自添 加Bml培养基，从而使得每个所述容器中的体积相等，并且制备所述培养基的多个等分部 分。8. 根据权利要求7所述的方法，其中，步骤c中的bFGF的所述预定量范围从约lng/ml 至约3ng/ml的所述培养基，优选地，约2ng/ml的所述培养基。9. 根据权利要求7所述的方法，其中，在步骤d中，以在完成所述步骤d之后，所述容器 2至X和X+1中的每一个包含等量培养基的方式，取出等量的所述培养基。10. 根据权利要求7所述的方法，其中，在步骤e中，以在完成所述步骤e之后，所述容 器2至X和X+1中的每一个包含1L培养基的方式，添加所述预定量的所述bFGF。11. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个预定汇合选自包括约30%至约 40%、约40%至约50%、以及约60%至约70%、或它们的任何组合的汇合范围。12. 根据权利要求1所述的方法，其中，通过使所述细胞与所述培养基接触的所述扩增 包括以下动作： a. 通过以范围从约1000个细胞/cm2至约7000个细胞/cm2的接种密度接种所述细胞 并且将所述培养基提供给所述接种的细胞，将所述培养的细胞扩增成连续传代；以及 b. 允许所述细胞达到约40 %至约50 %的预定汇合，并且更换所述培养基以获得所述 扩增的细胞； 其中，整个所述扩增中使用的所述培养基浓度范围从约0. 15ml/cm2至约0. 35ml/cm2。13. 根据权利要求12所述的方法，其中，所述扩增使细胞数目增加了至少30倍。14. 根据权利要求1所述的方法，其中，通过使所述细胞与所述培养基接触的所述扩增 包括以下动作： a. 通过在范围从约1000个细胞/cm2至约7000个细胞/cm2的接种密度接种所述细胞 并且将所述培养基提供给所述接种的细胞，将所述培养的细胞扩增成连续传代； b. 允许所述细胞达到约30 %至约40 %的预定汇合，并且在没有除去所述消耗培养基 的情况下，将所述培养基添加至所述细胞；以及 c. 允许所述细胞达到约60 %至约70 %的第二预定汇合，并且更换所述培养基以获得 所述扩增的细胞； 其中，整个所述扩增中使用的所述培养基浓度范围从约0. 15ml/cm2至约0. 35ml/cm2。15. 根据权利要求14所述的方法，其中，所述扩增使细胞数目增加了至少40倍。16. 根据权利要求1所述的方法，其中，通过使所述细胞与所述培养基接触的所述扩增 包括以下动作： a. 通过以范围从约1000个细胞/cm2至约7000个细胞/cm2的接种密度接种所述细胞 并且将所述培养基提供给所述接种的细胞，将所述培养的细胞扩增成连续传代； b. 允许所述细胞达到约40%至约50%的预定汇合，并且更换所述细胞的所述培养基； c. 通过以范围从约1000个细胞/cm2至约7000个细胞/cm2的接种密度接种所述细胞 并且将所述培养基提供给所述接种的细胞，进一步将步骤b的所述细胞扩增成第二连续传 代； d. 允许所述细胞达到约30 %至约40 %的预定汇合，并且在并不除去所述消耗培养基 的情况下，将所述培养基添加至所述细胞；以及 e. 允许所述细胞达到约60 %至约70 %的第二预定汇合，并且更换所述培养基以获得 所述扩增的细胞； 其中，整个所述扩增中使用的所述培养基浓度范围从约0. 15ml/cm2至约0. 35ml/cm2。17. 根据权利要求16所述的方法，其中，所述扩增使细胞数目增加了至少2000倍。18. 根据权利要求1所述的方法，其中，以范围从每ml冷冻混合物约5百万个细胞至约 0. 25亿个细胞的细胞密度，用冷冻混合物将在所述培养之后获得的所述细胞进行冷冻。19. 根据权利要求18所述的方法，其中，所述冷冻在范围从约-75摄氏度至约-85摄氏 度的温度下，或在范围从约-190摄氏度至约-200摄氏度的温度下进行；并且其中，所述冷 冻混合物包括浓度范围从约2%至约15%，优选地，约5%的冷冻保存剂；并且其中，所述冷 冻保存剂优选是DMSO。20. 根据权利要求19所述的方法，其中，所述细胞密度下的所述冷冻允许保留活力和 解冻后的功能。21. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括以下动作： a.在包括碱性成纤维细胞生长因子，S卩bFGF的培养基存在下，允许培养直至传代3次 的所述间质基质细胞扩增至传代5次； 其中，当所述细胞实现至少一个预定汇合时，通过使所述细胞与所述培养基接触进行 所述扩增；并且其中，当与所述传代3次的所述细胞数目相比时，所述方法使传代5次结束 时的所述细胞的数目增加了至少2000倍。22. 根据权利要求21所述的方法，其中，所述至少一个预定汇合选自包括约30%至约 40%、约40%至约50%、以及约60%至约70%、或它们的任何组合的汇合范围。23. 根据权利要求1所述的方法，其中，通过使所述细胞与所述培养基接触的所述扩增 包括以下动作： a. 通过以范围从约1000个细胞/cm2至约7000个细胞/cm2的接种密度接种所述传代 3次的细胞并且将所述培养基提供给所述接种的细胞，将所述培养至传代3次的细胞扩增 成传代4次； b. 允许所述细胞达到约40%至约50%的预定汇合，并且更换所述培养基； c. 通过以范围从约1000个细胞/cm2至约7000个细胞/cm2的接种密度接种所述细胞 并且将所述培养基提供给所述接种的细胞，进一步将在步骤b结束时获得的所述细胞扩增 成传代5次； d. 允许所述细胞达到约30 %至约40 %的预定汇合，并且在并不除去所述消耗培养基 的情况下添加所述培养基；以及 e. 允许所述细胞达到约60 %至约70 %的第二预定汇合，并且更换所述培养基以获得 所述扩增的细胞； 其中，整个所述扩增中使用的所述培养基浓度范围从约0. 15ml/cm2至约0. 35ml/cm2。24. 根据权利要求1所述的方法，其中，在配制成用于临床或治疗应用的预定剂型之前 将在所述培养过程之后获得的细胞进一步进行离心和洗涤过程的组合；并且其中，对于所 述预定剂量，所述组合将存在的牛血清白蛋白，即BSA的水平减少至低于50ng/ml的量，其 中，在通过所述培养基中的所述FBS的培养过程期间，将所述BSA提供给所述细胞。25. -种对于配制用于临床或治疗应用的剂量将BSA的量减少至低于50ng/ml水平的 方法，所述剂量包括通过培养所述细胞获得的间质基质细胞，所述方法包括以下动作：将所 述组合物进行离心和用磷酸盐缓冲盐水洗涤的组合以减少所述BSA的量。26. 根据权利要求25所述的方法，其中，在涉及使用牛源组分的培养所述细胞的过程 中，将高于50ng/ml量的所述BSA提供给所述细胞；并且其中，低于50ng/ml的水平不考虑 在所述剂量中所述细胞数目。27. 根据权利要求25所述的方法，其中，所述方法包括以下动作： a. 将所述细胞以范围从约1200rpm至约1800rpm的速度进行第一次离心持续范围从约 7分钟至约10分钟的时间段； b. 对于约60万至约6百万的范围内的细胞数目，将所述离心的细胞用约20ml的DPBS 进行第一次洗涤，并且在范围从约1200rpm至约1800rpm的速度下再次离心所述洗涤的细 胞持续约10分钟的时间段； c. 对于约600至约6百万的范围内的细胞数目，将所述再次离心的细胞用约7ml至约 9ml的DPBS进行第二次洗涤，随后可选地合并所述细胞样品；以及 d. 在范围从约1200rpm至约1800rpm的速度下，再次离心来自步骤c的所述洗涤的细 胞持续范围从约5分钟至约7分钟的时间段以获得具有低于50ng/ml的水平的BSA的所述 细胞。28. -种用于储存间质基质细胞的方法，所述方法包括以下步骤：在范围从每ml的所 述冷冻混合物约5百万个细胞至约0. 25亿个细胞的细胞密度下，使所述细胞经受冷冻混 合物，以及在范围从约-75摄氏度至约-85摄氏度的温度下或在范围从约-190摄氏度至 约-200摄氏度的温度下储存所述细胞。29. 根据权利要求28所述的方法，其中，在范围从每ml的所述冷冻混合物约5百万个 细胞至约〇. 25亿个细胞的细胞密度下并且在范围从约-75摄氏度至约-85摄氏度的温度 下，将所述间质基质细胞储存在冷冻混合物中允许在不存在液氮的情况下保留活力和解冻 后的功能持续至少1周的时间段。30. 根据权利要求28所述的方法，其中，在范围从每ml的所述冷冻混合物约5百万个 细胞至约〇. 25亿个细胞的细胞密度下并且在范围从约-190摄氏度至约-200摄氏度的温 度下，将所述间质基质细胞储存在冷冻混合物中允许保留活力和解冻后的功能持续至少1 个月的时间段。31. 根据权利要求28所述的方法，其中，所述冷冻混合物包括浓度范围从约4%至约 11 %，优选地，约5%的冷冻保存剂；并且其中，所述冷冻保存剂优选为DMSO。32. 根据权利要求28所述的方法，其中，在所述细胞密度下的所述冷冻允许保留活力 和解冻后的功能。33. 根据权利要求28所述的方法，其中，通过根据权利要求1所述的方法通过培养所述 细胞获得所述间质基质细胞。34. 根据权利要求28所述的方法，其中，在为了治疗目的给予需要其的受试者之前，所 述方法消除了所述细胞的重新构成。
【专利摘要】本发明公开了扩大间质基质细胞生产的方法、组合物及其试剂盒。本发明公开了用于临床级间质基质细胞(MSC)的一致生产的稳健制造方法。所述方法能够生产高活力的潜能细胞。微调与培养基的制备、细胞接种、细胞收获有关的过程步骤，以实现细胞产率的一致性、优良的细胞活力、纯度、改善的细胞增殖、较高的细胞恢复、较低的HLA-DR表达、培养持续时间减少。在不存在细胞损失/细胞应激的情况下，通过优化洗涤方法进一步改善了细胞的活力和纯度。本发明进一步提供了在高细胞密度下冷冻储存MSC而不影响细胞活力的方法。本发明进一步提供了在-80℃下储存和运输的经济手段。
【IPC分类】A01N1/02, C12N5/077, A61K35/35
【公开号】CN105274051
【申请号】CN201510095622
【发明人】乌代库马尔·科昆德卡尔, 斯瓦蒂·孙达尔·拉杰, 苏达·巴拉苏布拉马尼安, 查兰·泰伊, 阿什温·库尼贾尔·姆鲁特云贾亚, 德维·达莫达兰, 巴拉穆鲁甘·拉马达塞, 斯瓦鲁普·巴格瓦特, 阿尼什·森·马宗达
【申请人】斯蒂姆普优提克斯个人研究有限公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年3月3日
【公告号】CA2878299A1, EP2960329A1