组合物。
[0142] 优化方法最小化商品成本（C0G)，并且因此，改善产品的整体商业可行性。然而， 頂P制造方法的优化必须基于工业需求和/或GMP实践标准。治疗基质/干细胞产品的开 发和制造需要全面的质量控制（QC)以确保细胞的纯度。本公开涉及培养和扩增细胞，随后 收获、用DPBS洗涤并且离心以在降低最终产品中的BSA水平下获得可行并且较高的细胞产 率，这有助于进一步优化制造方法。进一步地，除了以上描述的用于培养和收获细胞以达到 传代3次的细胞的方法，常规使用的方法还可以应用在本公开的范围内。因此，本领域技 术人员将认识到用于达到P3细胞的培养的优化方法并且如以下描述的继续进行大规模生 产。
[0143] 大规樽牛产:
[0144] 本公开中的大规模生产开始于以实现优化的细胞培养基所需组分的正确比例制 备完全培养基，以大规模一致地制造临床质量的细胞。bFGF是细胞培养基中的重要组分 之一并且其浓度在细胞增殖和HLA-DR表达的过程中非常关键。为了提供精确均匀浓度的 bFGF并且避免任何体积误差，制备bFGF母液混合物，它与培养基连同其他组分混合以获得 完全培养基。在常规方法中，如果存在bFGF，将其添加至每个培养瓶/容器，从而导致细胞 质量的较大变化。
[0145] 在本方法中，大规模扩增过程中的培养基制备、种子制备和培养基进料循环的关 键暗示最大化頂P的效率和一致性。bFGF母液混合物的制备避免体积误差并且提供bFGF 对于培养基的均匀分布。进一步地，向所有细胞堆叠进料bFGF培养基改善了生长特性和细 胞产率的一致性。因此，相对于较高的细胞产率和细胞质量，对于维持生产过程中的一致 性，bFGF母液混合物提供了显著的贡献。
[0146] 下一个重要步骤是制备对于所有细胞堆叠提供均匀细胞分布的种子母液混合物， 从而增强MSC的均匀增殖并且在大规模扩增过程中贯穿整个细胞堆叠实现均匀汇合。
[0147] 当培养继续进行时，对于大规模扩增另一个关键的方面是进料时间表/进料周 期。通过培养容器中的细胞汇合限定进料周期频率。这确保较高的细胞增殖、细胞产率一 致性并且减少培养持续时间。
[0148] 根据頂P剂量制剂所需的细胞数目，可选地复活P3小瓶的具体数目（当冷冻保存 时）并且计数。
[0149] 提供给培养的每个阶段的培养基浓度范围从约0. 15ml/cm2至约0. 35ml/cm2,并且 因此，无论如此培养的细胞的量如何，根据用于培养细胞的表面积提供培养基的量。
[0150] 然后，通过在范围从约1000个细胞/cm2至约7000个细胞/cm2的接种密度下接 种细胞，在培养第一天用约〇. 15ml/cm2至约0. 35ml/cm2的培养基补充细胞，并且当实现约 40%至50%的汇合时进一步用约0.151111/〇11 2至约0.351111/〇112的培养基补充细胞，将传代3 次的细胞扩增至传代4次。当与传代3次结束时的细胞数目相比时，该阶段的细胞数目增 加了至少约30倍。
[0151] 进一步地，通过在范围从约1000个细胞/cm2至约7000个细胞/cm2的接种密度下 接种细胞，将这些细胞扩增成传代5次。在培养第一天，用约0. 15ml/cm2至约0. 35ml/cm2 的培养基补充这些细胞。在实现约30%至40%的汇合时，在并不除去消耗培养基（培养基 注满，mediatopup)的情况下，添加约0. 15ml/cm2至约0. 35ml/cm2的培养基。此后，当培 养达到约60 %至70 %的汇合时，进行完全培养基改变的步骤，其中，从所有TCS完全除去消 耗培养基并且添加〇. 15ml/cm2至约0. 35ml/cm2的培养基。当与传代3次结束时的初始细 胞数目相比时，该阶段的细胞数目增加了至少约2000倍。
[0152] 更特别地，作为示例性实施方式，通过在约1000个细胞/cm2的接种密度下将细胞 接种在一个细胞堆叠（具有约636cm2的表面积）中，在培养的第1天，用约150ml的培养 基补充细胞，并且当实现约40%至50%的汇合时，用约150ml的培养基进一步补充细胞，将 传代3次的细胞扩增至传代4次。该阶段获得的产率是约25-40X106个细胞/1CS，并且该 过程所需的总持续时间是约8至9天（图1中的A和图1中的B)。
[0153] 进一步地，在约1000个细胞/cm2/细胞堆叠的接种密度下，通过将细胞接种在十 个细胞堆叠（具有约636cm2X10 = 6360cm2的表面积）中将这些细胞扩增成传代5次。在 培养第一天，用约1. 5L培养基/细胞堆叠补充这些细胞。在实现约30%至40%的汇合后， 在并不除去消耗培养基（培养基注满）的情况下，将0.5L培养基添加至每个细胞堆叠。此 后，当培养物达到约60%至70%的汇合时，进行完全培养基改变的步骤，其中，从所有TCS 完全除去消耗培养基并且将约2L的新鲜培养基添加至每个细胞堆叠。该阶段获得的产率 是约450-600X106个细胞/10个细胞堆叠，并且该过程所需的总持续时间是约10至11天 (图 2)。
[0154] 前述培养的计算可以表示如下：
[0155] 1个细胞堆叠的体积是约600cm2至约700cm2。在约1000个细胞/cm2的接种密度 下，在1个细胞堆叠中在传代4次开始时接种的细胞的总数目是约6, 00, 000个细胞至约 7, 00, 000个细胞或约60万个细胞至约70万个细胞。由于细胞扩增，在传代4次结束时，细 胞数目增加至约〇. 25亿个细胞/细胞堆叠至约0. 4亿个细胞/细胞堆叠。
[0156] 然后，在约1000个细胞/cm2的接种密度下，将这些细胞再次接种在不同的细胞堆 叠中用于进一步扩增成传代5次。由于1个细胞堆叠可以容纳约60万至约70万个细胞， 容纳约0. 25亿个细胞至约0. 4亿个细胞所需的细胞堆叠的数目是约40个至约70个细胞 堆叠。现在，如以上提及的，由于来自传代4次结束至传代5次结束的细胞扩增提供了约 450-600X106个细胞/10个细胞堆叠，S卩，0. 45亿个细胞/细胞堆叠至0. 6亿个细胞/细胞 堆叠的细胞产率，对于约40个至约70个细胞堆叠的每一个这种扩增将导致18亿个细胞至 约42亿个细胞的范围内的总细胞数目。因此，从约60万至约70万个细胞开始，传代4次 和传代5次的扩增导致约18亿个细胞至约42亿个细胞的范围内的细胞总数目，从而将细 胞增加至少约2000倍。
[0157] 然而，可以在范围从约1000个细胞/cm2至约7000个细胞/cm2的密度下接种细 胞。在接种密度增加的情况下，培养的持续时间将因此改变并且实际上减小。进一步地，随 着将需要更小数目的细胞堆叠接种更大数目的细胞，培养基消耗也应更少。
[0158] 培养基进料的前述方法在大规模扩增中起重要作用，因为约30%至40%汇合下 的培养基注满（mediatopup)改善了MSC的增殖。进一步地，约60%至70%汇合下的完 全培养基改变（CMC)增强了增殖而没有损害大规模培养物的活力和质量。进一步地，CMC改 善了细胞产率一致性并且减少了培养持续时间。
[0159] 然后，将从大规模扩增过程中收获的细胞进行洗涤过程以除去所有杂质/颗粒， 尤其是由于在细胞培养过程中使用FBS在收获的细胞中发现的BSA。用于临床和/或治疗 应用的细胞组合物需要不含所有异源组分，并且无论细胞数目或这种组合物的体积如何， 对于这类组合物的每一种，BSA的水平总是需要小于50ng。本文中随后的洗涤过程包括以 下步骤：
[0160] 1.首先，将细胞在约1200rpm至约1800rpm下离心约lOmin。然后，用约200ml的 DPBS/10个细胞堆叠洗涤细胞，并且在约1200rpm至约1800rpm下再次离心约lOmin。
[0161] 2.在第二次洗涤中，每10个细胞堆叠添加约70ml至约90ml的洗涤缓冲液-DPBS， 随后合并来自所有细胞堆叠的细胞样品。
[0162] 3.在约1200rpm至约1800rpm下再次离心合并的细胞约5分钟至约7分钟。
[0163] 4.最后，在约25M细胞/ml下在CS5中将配制细胞球粒并且以2ml、4ml和8ml体 积冷冻。
[0164] 如以上指出的，洗涤步骤最小化BSA水平（即，<50ng)并且维持良好的活力以及 降低最终产品的生产过程中的细胞损失，所述最终产品是主要包含骨髓衍生的异源间质基 质细胞、CS5或CS10,或人血清白蛋白、勃脉力A和二甲基亚砜（DMS0)的组合物。在此，重 要的是注意，如之前指出的，在根据本公开的方案培养和洗涤细胞之后，根据临床和/或治 疗应用所需的剂量将细胞配制为MP或细胞组合物。无论细胞数目或组合物的体积如何， 任何这种MP或细胞组合物中的BSA的水平总是维持在50ng以下。
[0165] 在本领域中已知的是，使用包括勃脉力A、DMSO和人血清白蛋白（HSA)的冷冻混合 物/冷冻保存混合物冷冻保存细胞组合物。在临床需要时，根据临床给药的剂量需求，解冻 和重新构成冷冻保存的细胞。重新构成的过程在具有高度管制的环境的洁净室中进行，并 且还需要技术人员进行非常昂贵和耗时的处理。
[0166] 相反，本发明公开了一种方法，通过该方法细胞组合物可以容易地给药而不需要 在临床给药点重新构成的过程。这通过将通过以下操作实现：将通过本公开的培养方法获 得的MSC直接储存在具有相对较低的DMS0量的冷冻混合物中。一种这样合适的冷冻混合 物是Cryostor5(CS5)。因此，通过将MSC直接保存在CrystalZenith小瓶（CZ小瓶）中 的低DMS0冷冻保存培养基（优选Cryostor5(CS5))获得本公开的頂P。对于制备頂P或 通过本公开的培养步骤得到所需的细胞数目的方法，该步骤不是强制性的，但对于将细胞 产品最终投放市场用于临床和/或治疗应用而言是重要的。在该步骤中，细胞的高冷冻密 度是每ml的冷冻混合物约5-25百万个细胞。
[0167] 根据常规的已知方法，通常将细胞冷冻保存在负（_) 196°C下持续任何持续时间， 然而，在本公开中，将在较小体积中较高细胞密度（每ml的冷冻保存混合物/冷冻混合物 约5-25百万个细胞）冷冻保存在负（_)80°C下持续较短的持续时间以及在（_)196°C下持 续较长的持续时间。使用直接稳定性研究进行稳定性测试以检查产品保质期。
[0168] 进一步地，本公开还涉及称为'直接稳定性'的概念以改善頂P的保质期时间段， 其中，以每ml的CryoStor 50. 25亿个细胞将MSC冷冻在CZ小瓶中并且直接储存在负 (_)80°C下。细胞储存的这种方法并不涉及在-196Γ下任何暴露于液氮（如常规进行的）。 该操作为MSC的-80°C下的优良的短期储存提供了约1个月的时间段，并且避免危险的和昂 贵的基于液氮的冷冻储存操作。另一方面，如果IMP需要储存较长的时间，如超过几周或几 个月，优选地，超过1个月，在每ml冷冻保存液（优选CS5)约5百万至约0. 25亿个细胞的 高细胞密度下将获得自本公开的培养和洗涤过程的细胞冷冻保存在（_)196°C下。在解冻 时，负（_) 196°C下的高冷冻密度和储存的组合不会影响细胞活力和细胞恢复。
[0169] 在解冻时，高冷冻密度和在负（_)80°C或负（_) 196°C下CS5储存的组合不会影响 细胞活力和细胞恢复。因此，根据最佳结果的要求，将获得自以上使用的在DPBS洗涤之后 制备各种剂量的MP的方法的细胞以高冷冻密度储存在负（_)80°C或（_)196°C的CS5中。
[0170] 因此，通过在MSC的整个培养和储存过程中应用多种优化，本公开提供了用于各 种临床和/或治疗应用的增强的最终组合物。本公开的所述优化总结如下：
[0171] 培养阶段:
[0172] ?使用具有bFGF的培养基，将初始相对小数目的预培养的MSC(预培养至预定传代 如传代3次）进行扩增。通过母液混合消除体积误差和组分（特别是bFGF)的不一致性的 组分制备所述培养基，因为培养在多个容器（细胞堆叠）中同时进行以快速扩增细胞。组 分的常规混合不会在培养基中提供相等和一致体积的bFGF，从而导致在不同容器中细胞的 区分生长。因此，母液混合为整个培养过程提供了优点。
[0173] ?扩增过程的另一个重要方面是以再次避免/消除体积误差和组分的不一致性以 及来自批次间或容器间的差异的方式接种细胞悬浮液。
[0174] ?在母液混合培养基并且遵循本公开的接种方案后，进行从一代至另一代细胞扩 增，并且其中，如先前已知的，根据细胞汇合而不是培养的天数补充或注满（top)培养基。
[0175] ?所有前述方面总体导致MSC的高产率，导致细胞数目从初始数目多倍增加；以及 确保如此获得的MSC质量高、一致、免疫抑制和免疫有效的特性、以及较低的阴性标记物如 HLA-DR〇
[0176] 储存阶段:
[0177] ?-旦通过前述培养方法获得细胞，就可以配制它们用于储存或配制它们用于即 时给药用于临床和/或治疗目的。
[0178] ?通常，为了储存MSC的目的，冷冻保存液最常用于冷冻细胞。将MSC冷冻在冷冻 保存液中并且储存在液氮中，并且根据需要以及在需要时，解冻、重新构成并且用于临床和 /或治疗目的。重要的是注意，通常，这种冷冻保存液具有高浓度DMS0,它在给药之后可以 对人类造成毒性。因此，必要的是在细胞可以用于临床和/或治疗目的之前，通过稀释或洗 涤或从冷冻保存的细胞中完全除去DMS0降低毒性。进一步地，由于来自先前已知的方法的 冷冻和储存需要使用液氮，该过程需要洁净室设备和技术人员（因为液氮是危险的，其需 要小心处理）、以及具有挑战的昂贵装置。进一步地，这还将使得根本不可能同时储存细胞 和运输它们，从而使得整个过程不方便、繁琐并且具有挑战。
[0179] ?通过使用具有较少量的DMS0并且储存在_80°C下，允许保留稳定性、活力、免疫 特性和解冻后活力以及细胞的恢复的冷冻保存混合物在高冷冻密度下冷冻细胞，本公开避 免/消除重新构成的要求。冷冻细胞的这种方法对于细胞的短期储存是最佳的。
[0180] ?因此，本公开提供了根据以上公开的方案的细胞培养以获得高产率的MSC。然 后，这些MSC将以范围从每ml的CS5约5百万至约0. 25亿个细胞的高冷冻密度冷冻保存 在Cryostor 5(CS5)中，并且应优选在范围从约-70°C至约_80°C的温度下冷冻在CZ小瓶 中持续约1个月的时间段。相反，对于较长的储存，使用相同的细胞密度和冷冻保存液以将 细胞储存在-196 °C下。
[0181] ?由于并且当细胞需要用于临床和/或治疗应用时，当情况可以是并且仅是解冻 的时，从-80°C或_196°C的储存温度移开冷冻小瓶。不需要细胞重新构成，并且细胞以及 CS5可以直接给予需要其的受试者用于临床和/或治疗应用。
[0182] 额外的洗涤步骤:
[0183] ?即使在培养的最后阶段，使用包括任何牛组分的任何培养基培养的MSC也通常 结合以具有与它们一起存在的一定量的牛组分。换句话说，如果在任何阶段培养MSC涉及 使用任何牛组分，在最后阶段的收获的细胞将具有与细胞结合的一些牛组分的残留物。这 使得细胞不适于在人类中给药，并且因此，需要适当的洗涤和去除这类牛组分。
[0184] ?在本公开的培养过程中，在过程期间使用胎牛血清。FBS包含牛血清白蛋白 (BSA)，并且因此，在收获细胞后，必要的是除去这种BSA。先前已知的洗涤方法包括多次离 心和洗涤操作，所述洗涤方法由于多次离心不仅具有降低细胞损失和活力的风险，而且不 能够将与MSC相结合的BSA量减少至期望水平。在多次洗涤和离心过程中，本公开的新洗 涤方法和离心已经导致减少细胞损失并且增加活力，因此减少了细胞损失并且增加了最终 产品的细胞活力。
[0185] ?因此，本公开提供了克服先前已知技术的所述缺点并且在较少的离心循环下允 许进一步降低BSA水平的洗涤方法。
[0186] 因此，本公开的方法的优点如下：
[0187] i.在细胞数目、活力和HLA-DR表达方面，在所有十个细胞堆叠中具有批次间一致 性
[0188] a.细胞产率增加
[0189] b.细胞活力增加（图3A至3C)
[0190]c.HLA-DR的低表达（SP，〈5 % )(图 4A至 4D)
[0191] ii.生产过程期间减小的细胞损失
[0192] iii.最终产品中减少的杂质
[0193] iv.临床试验点处操作的减少。换句话说，