在不必重新构成/稀释细胞组合物的情 况下，制造给予患者的实验室到临床产品。
[0194] V.最终产品即可用在实验室，如同药用产品。
[0195] 通过以下实施例和附图进一步阐述了本公开内容。然而，这些实施例不应解释为 限制本公开的范围。
[0196] 实施例1 :
[0197] 骨髓衍牛的MSC的分离和细朐培养最高汰传代3次（P3)：
[0198] 在获得知情同意之后，在一般手术室中，在全身麻醉下使用肝素化注射器从髂嵴 的后上方吸取来自20-40岁年龄范围内的健康志愿者的约60-70ml骨髓，并且收集在单独 的血袋中。20ml注射器用于通过细胞滤网（cellstrainer) (100μπι)转移样品以除去骨 针、血块和细胞团块并且收集在离心管中。在取骨髓之前，针对作为强制筛选测试的人类免 疫缺陷病毒（HIV1)、乙型肝炎（HBV)、丙型肝炎（HCV)以及巨细胞病毒（CMV)，筛选志愿者。
[0199]在目前良好制造规范（cGMP)中进行骨髓处理和随后的培养。简要地，将骨髓用包 括Dulbecco改良的Eagle培养基knock-out(DMEM-KO) (80% )、胎牛血清（10% )、1Mmol的谷氨酰胺和50U/ml至lOOU/ml的青霉素以及50μg/ml至100μg/ml的链霉素的完全 培养基稀释（1:1)，并且在约1200rpm至约1800rpm下离心约10分钟至约20分钟以除去 抗凝剂。用于以上稀释的完全培养基缺乏bFGF。除去上清液并且再次用不具有bFGF的完 全培养基稀释骨髓。使用50ml离心管（Falcon，BectonDickinson)中的Lymphoprep，通过 密度梯度方法分离骨髓衍生的单核细胞（MNC)。该方法包括取另一离心管Lymphoprep[密 度梯度溶液]、添加双倍体积的稀释的骨髓并且在室温下在约1200rpm至ISOOrpm下离心 约10分钟至20分钟，其中，室温是20°C至25°C。分离积聚在棕黄层界面上的骨髓MNC并 且用缺乏bFGF的完全培养基再次洗涤。将分离的传代0次（P0)的单核细胞铺板在T-75 培养瓶（?&1(3〇11，136(31:〇110;^1<1118〇11)中，并且在补充有10%的胎牛血清（办(]1〇116)、2001]1]\1 的glutamax(Gibco-Invitrogen)、50U/ml至 100U/ml的青霉素以及 50μg/ml至 100μg/ ml的链霉素的DMEM-KO中培养，并且在37°C和5%潮湿的0)2下温育。在48h之后，除去未 粘附的细胞，并且进行培养基的第一次完全改变。随后，每隔48h补充培养基。频繁的培养 基更换主要确保MSC由于它们的独特的塑料粘附特性而附着至表面。在约80% -85%的期 望汇合后，吸出完全培养基并且用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS)洗涤细胞两次。每个 T-75烧瓶添加约l-2ml的胰蛋白酶并且在37°C下温育约2分钟至3分钟。胰蛋白酶的作 用使用包括DMEMK0、10%的FBS和青链霉素（Pen-Str印）[50U/ml至100U/ml的青霉素和 50μg/ml至100μg/ml的链霉素]的中和培养基中和，并且收集中和的样品并且在室温下 在约1200rpm至1500rpm下离心约10分钟至20分钟。向球粒（pellet)中添加完全培养 基，随后进行细胞计数。此后，使用包括约85%至95%的FBS和约5%至15%的DMS0的冷 冻培养基，以约1百万/ml的浓度将MSC冷冻在小瓶中，这被称作传代0次（P0)细胞（即， 1-2小瓶）。在第7天或第8天（培养期间）改变完全培养基，将其余细胞以约6, 666个细 胞/cm2的接种密度在细胞堆叠（cellstack)中培养/扩增，并且在第14天至第18天之 间用0. 25%的胰蛋白酶/EDTA(Gibco-Invitrogen)收获细胞。用包括DMEMK0、10%的FBS 和青链霉素[50U/ml至100U/ml的青霉素和50μg/ml至100μg/ml的链霉素]的中和培 养基中和胰蛋白酶化的细胞，并且收集在离心管中用于在约1200rpm至1500rpm下离心约 10分钟至20分钟。将球粒再悬浮在完全培养基中以评估细胞计数。在包括约85%至95% 的FBS和约5%至15%的DMS0的冷冻培养基中，以约1百万个细胞/ml至3百万个细胞/ ml的浓度将收获的细胞冷冻在小瓶中，这被称作传代1次（P1)细胞。将来自传代1次的 MSC在6, 666个细胞/cm2的接种密度下再铺板在单个单细胞堆叠中，并且在补充有10%的 胎牛血清（HyClone)、200mΜ的glutamax(Gibco-Invitrogen)、50U/ml至 100U/ml的青霉 素以及50μg/ml至100μg/ml的链霉素的DMEM-KO中培养，并且在37°C和5%潮湿的C02 下温育。简要地，方法如下：在其中从一名以上供体吸取初始骨髓的情况下，取出各自具有 P1细胞的一个小瓶，计数并且可选地以每个供体相等的比例合并。在计数并且可选地合并 供体细胞之后，检查细胞的活力；并且根据获得的细胞计数将有活力的细胞铺板在2-10个 室中。此后，将培养室转移至约37°C下的5%的C02培养箱。在每隔48-72小时之后，在显 微镜下观察细胞堆叠并且拍摄两张代表性的显微照片。用包括DMEM-KO、FBS、谷氨酰胺、青 链霉素和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)的新制备的完全培养基，每第7天至第8天补充 完全培养基。培养细胞直至室中的细胞约80% -85%汇合。
[0200] 一旦传代1次培养物汇合，通过收获汇合的培养物并且以1000个细胞/cm2的 接种密度进行接种将它们进一步扩增最高达传代3次，并且在补充有10 %的胎牛血清 (HyClone)、200mM的glutamax(Gibco-Invitrogen)、50U/ml至 100U/ml的青霉素和 50μg/ ml至100μg/ml的链霉素以及另外添加2ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)的生长 因子的DMEM-K0中培养，并且在37°C和5%的潮湿的C02下温育。对于大规模生产，将P3的 MSC铺板在一个 10-细胞堆叠（l〇-cellstack)(康宁生命科技，CorningLifeSciences) 上。简要地，方法如下：当P1细胞达到约80%至85%汇合时，吸出完全培养基并且将细胞 堆叠用DPBS洗涤两次。在添加洗涤胰蛋白酶，并且将细胞在约37°C下温育约4分钟至5分 钟之后，此后，用中和培养基将它们中和。收集中和的样品，并且在室温下在约1200rpm至 ISOOrpm下离心约10分钟至20分钟。对于因此获得的球粒，添加完全培养基并且进行细胞 计数。此后，为了另一次传代，在细胞堆叠中培养/扩增细胞，收获细胞并且离心。对于获 得的球粒，添加完全培养基并且进行细胞计数。在约_196°C下冷冻小瓶，使得每个小瓶在包 括约85 %至95 %的FBS和约5 %至15 %的DMS0的冷冻混合物中包括约1-3百万个MSC。 这形成传代3次（P3)的细胞，并且此后，用于未来的大规模扩增。
[0201] 制备頂P组合物
[0202]用于制备頂P或传代3次后的骨髓衍牛的基质细朐的最终组合物的方法
[0203] 用于制备頂P或骨髓衍生的MSC的最终组合物的方法通过首先培养细胞超过传代 3次开始以获得具有高质量和免疫特性的高产率MSC。在传代3次之后，所述方法通过首先 制备bFGF母液混合物（mastermix)以及包括该母液混合物的培养基用于均勾分布所述 bFGF而不存在任何体积误差开始。此后，所述方法包括制备种子母液混合物，随后根据定 义的用于进一步扩增细胞的时间表接种细胞、培养和改变培养基。然后，洗涤扩增的培养物 以除去BSA，并且根据所需的临床和/或治疗应用，将细胞继续用于制备最终组合物或頂P。 该方法进一步顺序地定义如下。
[0204] 1.制备包括用于培养和处理传代3次后的细朐的bFGF母液混合物的培养基:
[0205]bFGF母液混合物的制备避免了体积误差并且提供了bFGF对于用于细胞培养/扩 增的完全细胞培养基的均匀分布。因此，当添加至细胞堆叠时，制备的完全细胞培养基确保 提供给细胞均匀浓度的bFGF。该方法（图5A)改善了所有十层堆叠（stack)中的生长特 性一致性和细胞产率。因此，对于维持生产过程中的一致性、较高的细胞产率和细胞质量， bFGF母液混合物提供了显著的贡献。
[0206] 制备具有2ng/ml的bFGF的培养基:
[0207] 1.制备包括K〇-DMEM、FBS、Glutamax和青霉素/链霉素但缺乏bFGF的8L培养基， 并且分配到八个1L的无菌杯（Stericup)中并且从1至8标记。
[0208] 2.从培养基容器1号，吸取200ml培养基并且分配到标记为9号的无菌容器中。
[0209] 3.将1600ul的bFGF(即，16000ng的bFGF)添加至容器1号的800ml培养基，并 且充分地混合并且标记为bFGF母液混合物。
[0210] 4.从由2至8标记的每个容器取出100ml的培养基并且添加至容器9号的200ml 培养基，从而使得容器9号的总培养基体积成为900ml[来自容器1号的200ml+来自容器 2号至8号每一个的100ml]。
[0211] 5.取出100ml的bFGF母液混合物并且添加至各个900ml培养基（S卩，容器2号至 9号），并且所述容器每个的体积因此成为最高达1000ml。
[0212] 现在，从2至9标记的每个容器具有1L具有均匀分布的bFGF母液混合物的培养 基（包括2000ng的bFGF的1000ml培养基，S卩，2ng/ml的bFGF浓度）。该过程由图5A表 不。
[0213] 2.制备用在培养和处理传代3次后的细朐的种子母液混合物：
[0214] 种子母液混合物（seedmastermix)的制备避免体积误差并且提供对于所有细胞 堆叠的均匀细胞分布。对于在所有TCS中的均匀增殖和细胞产率的一致性的方法，种子母 液混合物（图5B)提供了显著的贡献。
[0215] 1.对于每个10CS，接种了 6. 36百万个有活力的细胞。接种5-10CS所需的总细胞 是0. 318亿个有活力的细胞和百万个细胞/ml的细胞悬浮液。
[0216] 2.取包含2ng/ml的bFGF培养基的一个培养基容器，除去31. 8ml的培养基并且添 加31. 8ml的细胞悬浮液。从具有从3号标记至7号的bFGF培养基的各个容器移开200ml 的培养基，并且单独地储存在无菌容器10号中。
[0217] 3.收集200ml的种子母液混合物并且转移至3号至7号容器的各800ml的培养 基。
[0218] 4.现在，每个容器具有存在细胞悬浮液的1000ml培养基。将1000ml的细胞悬浮 液接种至每一个10CS，并且分布至10CS的所有区室。
[0219] 5.最后，将另一个500ml培养基从容器8号至10号添加至每个10CS。每个10CS 的最终体积是1. 5L。
[0220] 该过程由图5B表示。
[0221] 在大规模生产过程中使用bFGF和种子母液混合物，图6A和6B提供了批次一致性 数据和降低的HLA-DR表达的细节。这些图还示出了与不包括这种bFGF母液混合物和种子 母液混合物的先前已知方法的比较。
[0222] 3.细朐接种、培养和培养基改夺时间表：
[0223] 通过以1000个细胞/cm2的接种密度将细胞接种在一个细胞堆叠中，在培养的第1 天，用以上制备的150ml的培养基补充细胞，并且当实现40-50%的汇合时，用150ml的培养 基进一步补充细胞，将传代3次的细胞扩增至传代4次。该阶段获得的产率是约25-40X106 个细胞/1CS，并且该过程所需的总持续时间是约8-9天。
[0224] 4.讲一步扩增细朐：
[0225] 进一步地，通过以1000个细胞/cm2的接种密度，将细胞接种在十个细胞堆叠中将 这些细胞扩增至传代5次。在培养第一天，用1. 5L培养基补充这些细胞。在实现约30-40% 的汇合后，在没有除去消耗培养基（spentmedium)(培养基注满（mediatopup))的情况 下，将0. 5L培养基添加至每个细胞堆叠。当培养物达到约60-70%的汇合时，进行完全培养 基改变的步骤，其中，从所有TCS中完全除去消耗培养基并且将2L的培养基添加至每个细 胞堆叠。该阶段获得的产率是450-600X106个细胞/10CS，并且与先前已知方法的14天 相比，该过程所需的总持续时间是约09-10天。由于在每个细胞堆叠60万至约70万个细 胞的相同接种密度下，在传代4次结束时获得的所有细胞在范围从约40至约70个细胞堆 叠的不同细胞堆叠中扩增，在传代5次结束时获得的细胞总数目范围从约18亿个细胞至约 42亿个细胞。
[0226] 5.洗涤处理：
[0227] 然后，将这些细胞进行包括以下步骤的洗涤处理：
[0228] -在约1200rpm至约1800rpm下第一次离心细胞约7分钟至约10分钟。然后，用 约200ml的DPBS/10个细胞堆叠洗涤细胞，并且在约1200rpm至约1800rpm下再次离心约 10分钟。
[0229] -在第二次洗涤中，每10个细胞堆叠添加约70ml至约90ml的洗涤缓冲液-DPBS， 随后合并细胞样品。
[0230] -在约1200rpm至约1800rpm下再次离心合并的细胞约5分钟至约7分钟。
[0231] 在用于传代3次之后细胞扩增的完全细胞培养基（如提供在表2中的）中，FBS 用作是牛源的补充物，并且因此，在临床应用之前，需要从产品中除去牛血清白蛋白（BSA)。 如以上指出的洗涤步骤降低了最终产品中的BSA水平（即，<50ng)，最终产品是在CS5中 主要包含骨髓衍生的异源MSC的组合物。同样，细胞组合物可以与CS10结合使用，或与人 血清白蛋白、勃脉力A(PlasmalyteA)和二甲基亚砜（DMS0)结合使用。优选地，最终细胞 组合物包含在约lml至约8mlCS5中约0. 25亿至约2亿个间质基质细胞。细胞密度/ml的 最终组合物可以是0. 25亿个细胞/ml的CS5、0. 5亿个细胞/2ml的CS5、4ml的CS5中1亿 个和/或8ml的CS5中2亿个细胞。图8A清楚地示出了按照以上公开的洗涤操作减少頂P 中的BSA。
[0232] 最终产品涕送和储存：将闵此获得的頂P冷冻保存在CrystalZenith小瓶（CZ小 瓶）中的配制培养基Cryostor5(CS5)中。还可以将其冷冻保存在袋小/瓶中以及冷冻 保存在用于细胞保存的任何其他冷冻保存培养基中。对于制备IMP的方法，该步骤不是强 制性的，但对于最终递送是重要的。在该步骤中，细胞的高冷冻密度是每ml的冷冻混合物 5-25百万个细胞，并且将MSC直接储存在负（_)80°C下。储存细胞的该方法对于较短的持 续时间是理想的，并且不包括在-196Γ下任何暴露于液氮。该方法确保细胞的优良的短期 储存，包括解冻时的高细胞活力和细胞恢复（cellrecovery)。
[0233] 另一方面，如果IMP需要储存较长的时期，如超过几周或几个月，优选地，超过1个 月，以每ml冷冻保存液约5百万至约0. 25亿个细胞的高细胞密度将获得自本公开的培养 和洗涤过程的细胞冷冻保存在（_)196°C下。在解冻时，高冷冻密度和在负（_)196°C下储存 的组合不会影响细胞活力和细胞恢复。
[0234] 以上操作主要涉及作为即可使用的病床边产品最终递送至市场。细胞类产品中的 主要挑战是以在不存在任何进一步的处理的情况下可以使用的方式递送细胞类产品。根据 常规操作，解冻储存在液氮中的细胞产品并且在给予患者之前进行重新构成。该过程需要 洁净室设备和对于最终市场递送具有挑战的技术人员。使用液氮进行细胞产品的储存和 运输是昂贵的方法，并且因此，在负（-)80°C下储存和运输细胞组合物的本操作具有成本效 益。
[0235] 因此，本公开提供了用于配制、储存和运输细胞组合物的过程，其中，将高数目的 细胞冷冻在较小体积的冷冻保存液中，其中，以5-25百万/mlCryoStor5的细胞密度冷冻 保存细胞，并且针对较短持续时间需求，将这些细胞直接保存在（_) 80°C下。
[0236] 在CS5中高冷冻密度和在负（_)80°C下储存的组合不会降低细胞活力和恢复。根 据冷冻或储存所需的持续时间，在-80°C或_196°C下在0. 25亿个细胞/ml的CryoStor5 的冷冻混