乙締柱(现有技术)上在pH 12对比研究相同的4种测试肤的色谱 图（表3)。
[004引发明详述 现在关于一些非限制性实施例和附图更确切地描述本发明。
[0049] 实验部分 材料 对于所有实验使用8.35ym平均粒径的多孔交联琼脂糖颗粒。
[0050] 在表1列出偶联试剂。
[0化1]表1.偶联试剂
实验1 :LS002597在琼脂糖颗粒上締丙基化和接枝聚苯乙締 締丙基化 将50mL琼脂糖颗粒在烧结玻璃滤器上用SOOmL蒸馈水洗涂。制备50% (w/w)氨氧化钢在 蒸馈水中的溶液，并用300ml的50%氨氧化钢溶液洗涂所述颗粒。将颗粒吸干并转移至装备 有机械揽拌器的250mL圆底烧瓶。添加40mL的50%氨氧化钢且溫度增加至50°C。揽拌速度设 置在25化pm。当溫度稳定时，添加50mL的締丙基缩水甘油酸。使反应进行过夜。
[0化2] 将颗粒悬浮体转移至烧结玻璃滤器并用SOOmL蒸馈水、500血乙醇和500mL的20%乙 醇洗涂所述颗粒。
[0053] 用滴定法确定连接的締丙基的量，发现为6 2 5y mo 1 /mL颗粒。
[0054] 接枝聚(苯乙締） 将如上制备的IOmL締丙基化琼脂糖颗粒在烧结玻璃滤器上用IOOmL甲苯洗涂。将颗粒 吸干并转移至50mL离屯、管（falcon Uibe)。添加15mL甲苯、15血苯乙締和270mg AMBN(构成 接枝溶液的甲苯和苯乙締）。将氮气冲洗通过颗粒悬浮体经5分钟。用盖密封离屯、管并放入 设置在70°C的加热振动台。使反应进行18小时。
[0055] 将颗粒悬浮体转移至烧结玻璃滤器并用SOOmL甲苯、300mL乙醇和IOOmL的20%乙醇 洗涂所述颗粒。
[0056] 实验2:LS002980用聚苯乙締(增加量的苯乙締)接枝締丙基化琼胶糖颗粒 将如在实验1制备的IOmL締丙基化琼脂糖颗粒在烧结玻璃滤器上用IOOmL甲苯洗涂。将 颗粒吸干并转移至50血离屯、管。添加 IOmL甲苯、20血苯乙締和360mg AMBN。将氮气冲洗通过 颗粒悬浮体经5分钟。用盖密封离屯、管并放入设置在7(TC的加热振动台。使反应进行18小 时。
[0化7] 将颗粒悬浮体转移至烧结玻璃滤器并用SOOmL甲苯、300mL乙醇和IOOmL的20%乙醇 洗涂所述颗粒。
[005引实验3:LS002597在琼胶糖颗粒上締丙基化和接枝聚(五氣苯乙締） 締丙基化 在烧结玻璃滤器上用2000mL蒸馈水洗涂200mL琼胶糖颗粒。制备氨氧化钢在蒸馈水中 的50%(w/w)溶液，并用1200mL的50%氨氧化钢溶液洗涂所述颗粒。将颗粒吸干并转移至装备 有机械揽拌器的1000 mL圆底烧瓶。加入160mL的50%氨氧化钢和1.2g棚氨化钢并将溫度增加 至50°C。揽拌速度设置在6(K)巧m。当溫度稳定时，添加200血的締丙基缩水甘油酸。使反应进 行过夜。
[0059] 将颗粒悬浮体转移至烧结玻璃滤器并用SOOmL蒸馈水、500血乙醇和500ml的20%乙 醇洗涂所述颗粒。
[0060] 用滴定法确定连接的締丙基的量，发现为50 Iymo 1 /mL颗粒。
[0061] 接枝聚(五氣苯乙締） 在烧结玻璃滤器上用IOOmL甲苯洗涂IOmL締丙基化的琼胶糖颗粒。将颗粒吸干并转移 至50mL离屯、管。添加15血甲苯、15mL五氣苯乙締和270mg AMBN。将氮气冲洗通过颗粒悬浮体 经5分钟。用盖密封离屯、管并放入设置在7(TC的加热振动台。使反应进行18小时。
[0062] 将颗粒悬浮体转移至烧结玻璃滤器并用300mL丙酬、300mL乙醇和IOOmL的20%乙醇 洗涂所述颗粒。
[0063] 实验4:LS003147A，在琼胶糖颗粒上締丙基化和接枝聚(叔下基苯乙締） 締丙基化 如实验3将200mL琼胶糖颗粒締丙基化。连接的締丙基的量用滴定法确定，并发现为501 ymol/mL 颗粒。
[0064] 接枝聚(叔下基苯乙締） 在烧结玻璃滤器上用IOOmL甲苯洗涂IOmL締丙基化的琼胶糖颗粒。将颗粒吸干并转移 至50mL离屯、管。添加15血甲苯、15mL叔下基苯乙締和270mg AMBN。将氮气冲洗通过颗粒悬浮 体经5分钟。用盖密封离屯、管并放入设置在7(TC的加热振动台。使反应进行18小时。
[0065] 将颗粒悬浮体转移至烧结玻璃滤器并用SOOmL甲苯、300mL乙醇和IOOmL的20%乙醇 洗涂所述颗粒。
[0066] 实验5:在原型和参比产品上的肤分离。
[0067] 在不同pH值的4种肤用作色谱评估方法的测试肤。所述肤的一些性质在表中列出。 [006引表2.肤性质
原型和柱 将本发明的RPC原型材料(见实验1-4)填充到IYicorn 5/50柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB) 0.98mL柱。此外，为了对比，将SOURCE 15 RPC (GE Healthcare Bio-Sciences AB)和Kromasil 100-13-C4 (Akzo Nobel)填充入Tricorn 5/50柱。祉TA (TM?) Explorer IOS系统（GE Healthcare Bio-Sciences AB)用于运行分离方法 用于分离方法的材料在表3中列出。
[0069] 表3.用于分离方法的肤和其它化学品物质
缓冲剂制备 15mM憐酸钢pH 3.0缓冲剂： 将0.176mL憐酸和1.7Ig-水合憐酸二氨钢在Mi 11 i Q水中溶解至IL终体积。
[0070] 15mM憐酸钢抑7.0缓冲剂： 将1.032g-水合憐酸二氨钢和1.068g憐酸氨二钢溶解至IL终体积。
[0071] 将10 ml氨氧化钢用作抑12溶液。使用Titrisol安飯制备溶液，用Milli-Q水稀释 至IL终体积。
[0072] 肤分离方法。
[0073] 测试肤:将血管紧张素 I、Ile7-血管紧张素 III、Val4-血管紧张素 III和血管紧张 素 HI溶于Mi 11 i-Q水，对于各种肤至0.125mg/mL的终浓度。
[0074] 在抑3.0及抑7.0和12.0下进行分离。
[00对 A缓冲剂是15mM憐酸钢，pH 3.0或抑7.0,或IOmM化OH,pH 12。8缓冲剂是乙腊。W 下给出所述方法的综述：
UV 215皿用作检测波长。
[0076] 取决于抑，肤将为带正电的（pH 3)、几乎不带电的(pH 7)或带负电的(pH 12)。肤 的电荷可影响分离。如果例如带负电的基团存在于颗粒上，则运可导致在低抑下峰加宽，因 为随后将通过离子相互作用和疏水相互作用两者保留带正电的肤。
[0077] 图1-3分别显示原型LS002597在抑7、pH 3和抑12分离的色谱图。
[0078] LS002597具有非常良好的总体性能，在所有抑值有尖锐的峰。所述肤中的一种在 pH 12不结合，所述肤在抑12强烈地带负电。
[00巧]图4-6分别显示原型LS002980在pH 7、pH 3和pH 12分离的色谱图。LS002980具有 非常良好的总体性能，而且是具有充分疏水性W维持全部4种肤在pH 12(在此获得优良的 分离)的少数原型之一。在抑3的分离得到比例如LS002597稍微更宽的峰，但在pH 7的分离 与Kromasil C4 IOOA高度等同。
[0080] 图7-9分别显示原型LS002889在抑7、pH 3和抑12分离的色谱图。
[0081] 用聚(五氣苯乙締)接枝的原型化S002889)得到在所有pH值下良好的分离，分离模 式类似于LS002597。
[0082] 图10-12分别显示原型LS003147A在抑7、pH 3和抑12下分离的色谱图。叔下基苯 乙締化S003147A)产生非常良好的总体性能。
[0083] 图13-14是显示Kromasil C4 IOOA的色谱图的比较图，分别在抑7和抑3。
[0084] Kromasil柱在抑7产生良好的分离，但不能在抑3分离肤，仅观察到S个峰。所有 肤的保留时间比基于琼胶糖原型长得多。运意味着在运种情况下必须用更多有机溶剂来洗 脱肤。在pH 12的分离对于Kromasil柱不能进行，因为基于二氧化娃的产物产品在pH~8W 上不稳定。
[0085] 图15-17是显示在抑7、pH 3和抑12下Source 15 RPC的色谱图的对比图。SOURCE 15 RPC柱显示在抑3的良好分离，但在抑7和12均产生不良分离和宽峰。
【主权项】
1. 一种用于生产反相色谱(RPC)材料的方法，所述方法包含以下步骤:在多孔碳水化合 物颗粒上引入不饱和基团和在所述包含不饱和基团的颗粒上接枝苯乙烯类单体。2. 权利要求1的方法，其中所述多孔碳水化合物颗粒由多糖材料组成。3. 权利要求1或2的方法，其中所述多孔碳水化合物颗粒由琼脂糖组成。4. 权利要求1、2或3的方法，其中所述不饱和基团为烯丙基。5. 权利要求4的方法，其中用烯丙基缩水甘油醚(AGE)进行烯丙基化。6. 上述权利要求中一项或多项的方法，其中所述苯乙烯类单体选自苯乙烯、叔丁基苯 乙烯或五氟苯乙烯。7. 上述权利要求中一项或多项的方法，其中所述接枝溶液中的苯乙稀类单体v/v为5至 95%(v/v)，优选25至75%。8. 上述权利要求中一项或多项的方法，其中用AGE烯丙基化，且所述苯乙烯类单体为苯 乙稀或叔丁基苯乙稀，以50% v/v存在于所述接枝溶液中。9. 一种根据上述权利要求中一项或多项生产的RPC材料。10. 根据权利要求8生产的RPC材料。11. 权利要求9或10的RPC材料进行反相色谱的用途。
【专利摘要】本发明涉及一种用于生产色谱材料的方法。更确切地，本发明涉及一种用于生产反相色谱(RPC)材料的方法，该方法包含以下步骤：在多孔碳水化合物颗粒上引入不饱和基团和在所述包含不饱和基团的颗粒上接枝苯乙烯类单体。
【IPC分类】G01N33/538, C08F212/08, B01J20/285, C08F251/00, B01D15/32, B01J20/289, C08B37/12, B01J20/22, B01J20/287
【公开号】CN105658325
【申请号】
【发明人】T.E.塞德曼
【申请人】通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年10月9日