生产色谱材料的方法
【专利说明】生产色谱材料的方法 发明领域
[0001] 本发明设及一种用于生产色谱材料的方法。更确切地，本发明设及一种通过色谱 颗粒表面改性生产反相色谱(RPC)材料的方法。
[0002] 发明背景 吸附色谱取决于溶质分子和化学接枝到色谱基体的特定设计的配体之间的化学相互 作用。多年来，利用从电子电荷到生物亲和力的多种生化特性，已将许多不同类型的配体固 定到色谱载体用于生物分子纯化。对用于生物分子制备色谱的吸附技术范围的一种重要补 充是反相色谱，其中流动相溶质结合至固定的正烷基控或芳族配体经由疏水性相互作用发 生。反相色谱在生化分离和纯化领域内具有分析和制备两种应用。具有一定程度疏水特性 的分子，例如蛋白质、肤和核酸，可通过反相色谱W优良的回收率和分解度分离。此外，流动 相中的离子配对修饰剂允许带电溶质（例如完全脱保护的低聚核巧酸和亲水肤）的反相色 谱。制备型反相色谱应用于从蛋白质片段微纯化用于测序到重组蛋白质产物的生产规模纯 化。
[0003] 反相色谱的分离机制取决于流动相中的溶质分子和固定的疏水配体即固定相之 间的疏水性结合相互作用。疏水性结合相互作用自身的实际特性是激烈争论的问题，但常 规知识假定结合相互作用是有利的赌效应的结果。用于反相色谱的初始流动相结合条件主 要为水性的，运表明在溶质分子和固定配体两者周围的高度组织化水结构。在溶质结合到 固定的疏水配体时，暴露于溶剂的疏水面积最小化。因此，组织化水结构的程度随着相应的 系统赌的有利增加而减小。W运种方式，从能量观点来看，疏水部分即溶质和配体缔合是有 利的。
[0004] 反相色谱是实验设计的吸附方法，其依赖于影响分离的分配机制。溶质分子在流 动相和固定相之间分配（即建立平衡）。溶质在两相之间的分布取决于介质的结合性质、溶 质疏水性和流动相组成。初始，实验条件设计成有利于溶质从流动相吸附至固定相。随后， 改变流动相组成W有利于溶质从固定相脱附回到流动相中。在运种情况下，认为吸附是溶 质分子分布基本上100%在固定相内的极端平衡状态。相反地，脱附是溶质基本上100%分布 在流动相内的极端平衡状态。
[0005] 生物分子反相色谱通常使用梯度洗脱而不是等度洗脱。虽然生物分子在水性条件 下强烈吸附于反相基体表面，但它们在非常窄的有机修饰剂浓度窗内从基体脱附。连同运 些具有其独特吸附性质的高分子量生物分子，典型的生物试样通常含有宽的生物分子混合 物，具有相应多样化的吸附亲和力范围。因此，用于复杂生物试样反相分离的唯一实用方法 为梯度洗脱。
[0006] 总之，反相色谱中的分离取决于具有不同程度疏水性的溶质分子对疏水固定相的 可逆吸附/脱附。
[0007] 色谱过程中的第一步为在适合的初始流动相条件下使被反相介质填充的柱平衡， 所述流动相条件为抑、离子强度和极性(流动相疏水性）。通过添加有机修饰剂例如乙腊来 控制流动相的极性。离子配对剂例如=氣乙酸也可能是适当的。初始流动相(通常称为流动 相A)的极性必须低得足W溶解部分疏水的溶质，但高得足W保证溶质结合到反相色谱基 体。在第二步骤中，施用包含要分离的溶质的样品。理想地，将样品溶于用于使色谱床平衡 的相同流动相中。W发生最优结合的流速将样品施用于柱。一旦施用样品，进一步用流动相 A洗涂色谱床，W去除任何未结合和不需要的溶质分子。
[0008] 结合的溶质随后通过调节流动相的极性从反相介质脱附，使得结合的溶质分子连 续脱附并从柱洗脱。在反相色谱中，运通常包括通过增加有机修饰剂在流动相中的百分比 来降低流动相的极性。运通过维持最终流动相(流动相B)中有机修饰剂的高浓度来实现。通 常，初始和最终流动相溶液的抑保持相同。通过从含有极少或没有有机修饰剂的100%初始 流动相A到含有较高有机修饰剂浓度的100%(或更少)流动相B的增加线性梯度，实现流动相 极性的逐渐下降(增加流动相疏水性）。根据其各自的疏水性，结合的溶质从反相介质脱附。
[0009] 过程中的第四步骤包括去除先前未脱附的物质。运通常通过将流动相B改变到接 近100%有机修饰剂W保证在再使用柱之前完全去除全部的结合物质来实现。
[0010] 第五步骤是色谱介质从100%流动相B回到初始流动相条件的再平衡。
[0011] 反相色谱中的分离是由于存在于样品中的溶质的不同结合性质（因为它们疏水性 质的差异）。可通过操纵初始流动相的疏水性质，控制溶质分子结合至反相介质的程度。虽 然溶质分子的疏水性难W定量，但容易实现其疏水性质仅轻微变化的溶质的分离。因为其 优良的分解能力，反相色谱是用于复杂生物分子高性能分离的不可缺少的技术。
[0012] 通常，初始使用从100%流动相A至100%流动相B的宽范围梯度实现反相分离。初始 和最终流动相两者中有机修饰剂的量还可极大地变化。然而，有机修饰剂的常规百分数为 在流动相A中5%或更少和在流动相B中95%或更多。
[0013] 反相色谱技术允许分离条件的巨大灵活性，使得研究人员可选择结合所关注的溶 质，使污染物无延迟地通过柱，或结合污染物，使期望的溶质自由通过。通常，更合适的是结 合所关注的溶质，因为脱附的溶质W浓缩状态从色谱介质洗脱。另外，因为在初始流动相条 件下的结合是完全的，所W样品溶液中期望溶质的起始浓度不关键，允许稀释的样品施用 于柱。
[0014] 反相色谱介质由化学接枝到多孔的不溶珠粒基体的疏水配体组成。基体必须在化 学上和力学上都是稳定的。用于市售可得的反相介质的基础基体通常由二氧化娃或合成有 机聚合物例如聚苯乙締组成。
[0015] 当选择用于反相分离的缓冲条件时，抑是高度影响分离特性的参数之一。此外，也 必须考虑祀分子的稳定性。因此，需要可在宽pH范围内（例如pH 3-12)使用的反相色谱介 质，W产生在选择最优pH方面的用户最大自由度。
[0016] 虽然由二氧化娃和聚苯乙締制成的RPC介质在很多情况下功能令人满意，但它们 不能在宽抑范围内使用。先前，在聚合(例如交联聚苯乙締)载体上接枝苯乙締，导致孔结构 改变，已显示得到膜岛素分离方面的一定改善，见US 7,048,858 B2。聚苯乙締在宽的抑范 围内化学稳定，但与二氧化娃相比在许多pH值下遭受较差的选择性。
[0017] 另一方面，在大于~8的抑下长期使用期间，二氧化娃不稳定。
[0018] 因此，仍需要在宽抑范围内显示良好选择性的改进的RPC介质。 发明概要
[0019] 本发明提供一种用于生产基于多孔碳水化合物颗粒的RPC材料的方法，所述RPC材 料承受对机械强度的需求并在宽抑范围内得到高选择性。
[0020] 因此在第一方面，本发明提供一种用于生产反相色谱(RPC)材料的方法，该方法包 含W下步骤:在多孔碳水化合物颗粒上引入不饱和基团和在所述包含不饱和基团的颗粒上 接枝苯乙締类单体。
[0021 ]多孔碳水化合物颗粒优选由多糖材料制成，最优选琼脂糖。
[0022] 琼脂糖先前成功地用于疏水相互作用色谱（HIC)，且许多商品是可得的，例如 Butyl Sepharose Fast Flow (GE Healthcare)。用于HIC的产品应仅溫和疏水，且由于琼 脂糖固有的亲水性和难W使之足够疏水，未考虑琼脂糖用于其中需要高度疏水载体的反相 色谱。
[0023] 本发明人意外地发现，通过在交联琼脂糖颗粒上接枝苯乙締，已发现在整个pH范 围内足够疏水性与良好选择性的组合，运是二氧化娃或聚苯乙締载体都不显示的。
[0024] 在生产方法中，不饱和基团优选为締丙基。
[0025] 在所述方法的一个实施方案中，用締丙基缩水甘油酸(AGE)进行締丙基化。
[00%] 苯乙締类单体可选自例如苯乙締、叔下基苯乙締或五氣苯乙締。
[0027] 接枝溶液中的苯乙締类单体v/v优选W5至95%(v/v)，优选25至75%的量存在。
[0028] 在一个优选实施方案中，用AGE締丙基化，且苯乙締类单体为苯乙締或叔下基苯乙 締，W50% v/v存在于接枝溶液中。
[0029] 在第二方面，本发明设及根据上述方法生产的RPC材料。
[0030] 在第S方面，本发明设及上述生产的RPC材料进行反相色谱的用途。
[0031] 附图简述 图1显示在RPC原型LS002597(见W下表6)上在pH 7分离4种测试肤的色谱图（见W下表 3)。
[0032] 图2显示在RPC原型LS002597(见W下表6)上在抑3分离4种测试肤的色谱图（见W 下表3)。
[0033] 图3显示在RPC原型LS002597(见W下表6)上在抑12分离4种测试肤的色谱图（见 W下表3)。
[0034] 图4显示在RPC原型LS002980(见W下表6)上在抑7分离4种测试肤的色谱图（见W 下表3)。
[00巧]图5显示在RPC原型LS002980(见W下表6)上在抑3分离4种测试肤的色谱图（见W 下表3)。
[0036] 图6显示在RPC原型LS002980(见W下表6)上在抑12分离4种测试肤的色谱图（见 W下表3)。
[0037] 图7显示在RPC原型LS002889(见W下表6)上在抑7分离4种测试肤的色谱图（见W 下表3)。
[0038] 图8显示在RPC原型LS002889(见W下表6)上在抑3分离4种测试肤的色谱图（见W 下表3)。
[0039] 图9显示在RPC原型LS002889(见W下表6)上在抑12分离4种测试肤的色谱图（见 W下表3)。
[0040] 图10显示在RPC原型LS003147A(见W下表6)上在抑7分离4种测试肤的色谱图（见 W下表3)。
[0041 ] 图11显示在RPC原型LS003147A(见W下表6)上在抑3分离4种测试肤的色谱图（见 W下表3)。
[00创图12显示在RPC原型LS003147(见W下表6)上在抑12分离4种测试肤的色谱图（见 W下表3)。
[0043] 图13显示在二氧化娃柱(现有技术)上在抑7对比研究相同的4种测试肤的色谱图 (表3)。
[0044] 图14显示在二氧化娃柱(现有技术)上在抑3对比研究相同的4种测试肤的色谱图 (表3)。
[0045] 图15显示在聚苯乙締柱(现有技术)上在抑7对比研究相同的4种测试肤的色谱图 (表3)。
[0046] 图16显示在聚苯乙締柱(现有技术)上在抑3对比研究相同的4种测试肤的色谱图 (表3)。
[0047] 图17显示在聚苯