产地的猴头菇子实体多糖粗品1mg,分别配成10mg/mL的多糖水溶液,然后将500yL的多糖水溶液置于5mL安培瓶中,并加入0.4mol/L三氟乙酸500yL,再充入氮气后用酒精喷灯封口,然后置于110°C的烘箱中水解5h,反应完全后,取出,放置冷却,再用氮气吹干;然后分别加入ImL的甲醇,搅拌后再用氮气吹干,重复上述加入甲醇并用氮气吹干的步骤三次以除去三氟乙酸;然后将残渣加入热水中溶解,并转移至2mL的比色管中,加水至刻度,摇匀后得到水解产物;
(2)猴头菇子实体多糖水解产物的PMP衍生化反应:吸取400yL的上述第(I)步得到的水解产物,加入400yL 0.5M PMP的甲醇溶液和400yL 0.3M氢氧化钠溶液,混匀后,于70°C的水浴中反应75min,冷却后加入400yL 0.3M盐酸中和,反应液在50°C下旋蒸至干,然后加入2mL水和ImL氯仿,漩涡振荡混匀,再离心处理;然后取上层水溶液,再往上层水溶液中加入氯仿,重复上述操作直至氯仿层无颜色为止,再将最后的水相用0.22μπι的微孔膜过滤后,得到PMP衍生化产物;
(3 )ΡΜΡ衍生化产物的反相高效液相色谱分析:分别对第(2 )步得到的PMP衍生化产物和混合单糖标准品进行进样,分别得到混合单糖标准品的色谱图和16种不同产地的猴头菇子实体多糖的HPLC指纹图谱;并以葡萄糖峰为参照峰,计算混合单糖标准品和PMP衍生化产物中各峰的相对保留时间,并以峰面积归一化法计算PMP衍生化产物图谱各峰的相对峰面积;其中,反相高效液相色谱分析的条件为:色谱柱:D1nex Acclaim 120 C18(4.6 X250mm,5μπι);流动相:15%?25%(V/V)乙腈(A)—0.1M pH6.7磷酸盐缓冲液(B);检测波长:245nm~255nm ;柱温:20-35 °C ;进样量:5?15yL ;流速:0.3?I.5mL/min ;
(4)HPLC标准指纹图谱的建立:通过比较16个不同产地的猴头菇子实体多糖的HPLC指纹图谱,并运用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件,建立猴头菇子实体多糖HPLC标准指纹图谱;通过分析比较,确定有16个共有特征峰,其相对保留时间tR(以葡萄糖峰S13为参照峰)分别为0.135 min、0.422min、0.458 min,0.478min、0.507 min、0.536 min、0.597 min、0.610 min、0.626 min、0.651 min、0.691 min、0.954 min、1.000 min、1.149 min、1.212 min和1.433 min。
[0031]实施例
[0032]猴头菇子实体三维指纹图谱的构建方法,其特征在于:它包括以下步骤:
步骤一,猴头菇子实体多糖的提取:
分别称取16种不同产地的猴头菇子实体粉末2g于容器中,并加入40mL的水,然后于80°C的水浴中震荡6h,再冷却并离心处理,然后收集上清液并减压蒸发浓缩后置于透析袋中进行透析12,再将透析物进行真空冷冻干燥,得到猴头菇子实体多糖粗品;
步骤二,猴头菇子实体多糖的FTIR指纹图谱的构建:
分别称取步骤一得到的16种不同产地的猴头菇子实体多糖粗品2mg,加入10mg的溴化钾,研磨后取样进行测定,检测波数为4000?400cm—I在此条件下得到16种不同产地的猴头菇子实体多糖的FTIR指纹图谱,并通过平均值法建立16种不同产地的猴头菇子实体多糖的FTIR标准指纹图谱;比较不同产地的猴头菇子实体多糖的FTIR标准指纹图谱,并确定有11个共有特征吸收峰,其吸收波长λ—Hcnf工)分别为576.71、887.25、1056.99、1242.15、1404.17、1533.40、1647.20、2933.72、3385.07、3749.61和3855.70;
步骤三:猴头菇子实体多糖的UV指纹图谱的构建:
分别称取步骤一得到的16种不同产地的猴头菇子实体多糖粗品8mg,配成80yg/mL的多糖水溶液,于200nm?600nm波长区间进行扫描得到猴头菇子实体多糖紫外全波长扫描光谱图,并通过平均值法建立16种不同产地的猴头菇子实体多糖的UV标准指纹图谱,得出在200nm?220nm和260nm?280nm处有吸收,且在215nm处吸收值最大;
步骤四,猴头菇子实体多糖的HPLC指纹图谱的构建:
(1)猴头菇子实体多糖的水解:分别称取步骤一得到的16种不同产地的猴头菇子实体多糖粗品8mg,分别配成8mg/mL的多糖水溶液,然后将500yL的多糖水溶液置于5mL安培瓶中,并加入0.3mol/L三氟乙酸500yL,再充入氮气后用酒精喷灯封口,然后置于100°C的烘箱中水解6h,反应完全后,取出,放置冷却,再用氮气吹干;然后分别加入ImL的甲醇,搅拌后再用氮气吹干,重复上述加入甲醇并用氮气吹干的步骤三次以除去三氟乙酸;然后将残渣加入热水中溶解,并转移至2mL的比色管中,加水至刻度,摇匀后得到水解产物;
(2)猴头菇子实体多糖水解产物的PMP衍生化反应:吸取400yL的上述第(I)步得到的水解产物,加入400yL 0.5M PMP的甲醇溶液和400yL 0.3M氢氧化钠溶液,混匀后,于60°C的水浴中反应90min,冷却后加入400yL 0.3M盐酸中和,反应液在40°C下旋蒸至干,然后加入2mL水和ImL氯仿,漩涡振荡混匀,再离心处理;然后取上层水溶液,再往上层水溶液中加入氯仿,重复上述操作直至氯仿层无颜色为止,再将最后的水相用0.22μπι的微孔膜过滤后,得到PMP衍生化产物;
(3 )ΡΜΡ衍生化产物的反相高效液相色谱分析:分别对第(2 )步得到的PMP衍生化产物和混合单糖标准品进行进样,分别得到混合单糖标准品的色谱图和16种不同产地的猴头菇子实体多糖的HPLC指纹图谱;并以葡萄糖峰为参照峰,计算混合单糖标准品和PMP衍生化产物中各峰的相对保留时间,并以峰面积归一化法计算PMP衍生化产物图谱各峰的相对峰面积;其中,反相高效液相色谱分析的条件为:色谱柱:D1nex Acclaim 120 C18(4.6 X250mm,5μπι);流动相:15%?25%(V/V)乙腈(A)—0.1M pH6.7磷酸盐缓冲液(B);检测波长:245nm~255nm ;柱温:20-35 °C ;进样量:5?15yL ;流速:0.3?I.5mL/min ;
(4)HPLC标准指纹图谱的建立:通过比较16个不同产地的猴头菇子实体多糖的HPLC指纹图谱,并运用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件,建立猴头菇子实体多糖HPLC标准指纹图谱;通过分析比较,确定有16个共有特征峰,其相对保留时间tR(以葡萄糖峰S13为参照峰)分别为0.135 min、0.422min、0.458 min,0.478min、0.507 min、0.536 min、0.597 min、0.610 min、0.626 min、0.651 min、0.691 min、
0.954 min、1.000 min、1.149 min、1.212 min和1.433 min。
[0033]实施例4。
[0034]猴头菇子实体三维指纹图谱的构建方法,其特征在于:它包括以下步骤:
步骤一,猴头菇子实体多糖的提取:
分别称取16种不同产地的猴头菇子实体粉末3g于容器中,并加入60mL的水,然后于85°C的水浴中震荡5h,再冷却并离心处理,然后收集上清液并减压蒸发浓缩后置于透析袋中进行透析18h,再将透析物进行真空冷冻干燥,得到猴头菇子实体多糖粗品;
步骤二,猴头菇子实体多糖的FTIR指纹图谱的构建:
分别称取步骤一得到的16种不同产地的猴头菇子实体多糖粗品3mg,加入150mg的溴化钾,研磨后取样进行测定,检测波数为4000?400cm—I在此条件下得到16种不同产地的猴头菇子实体多糖的FTIR指纹图谱,并通过平均值法建立16种不同产地的猴头菇子实体多糖的FTIR标准指纹图谱;比较不同产地的猴头菇子实体多糖的FTIR标准指纹图谱,并确定有11个共有特征吸收峰,其吸收波长λ—Hcnf工)分别为576.71、887.25、1056.99、1242.15、
1404.17、1533.40、1647.20、2933.72、3385.07、3749.61和3855.70;
步骤三:猴头菇子实体多糖的UV指纹图谱的构建:
分别称取步骤一得到的16种不同产地的猴头菇子实体多糖粗品12mg,配成120yg/mL的多糖水溶液,于200nm?600nm波长区间进行扫描得到猴头菇子实体多糖紫外全波长扫描光谱图,并通过平均值法建立16种不同产地的猴头菇子实体多糖的UV标准指纹图谱,得出在200nm?220nm和260nm?280nm处有吸收,且在215nm处吸收值最大;
步骤四,猴头菇子实体多糖的HPLC指纹图谱的构建:<