g?3mg,加入10mg?150mg的溴化钾,研磨后取样进行测定。
[0013]上述技术方案中,所述步骤三猴头菇子实体多糖的UV指纹图谱的构建步骤中,分别称取步骤一得到的16种不同产地的猴头燕子实体多糖粗品8mg?12mg,配成80yg/mL?120μg/mL的多糖水溶液。
[0014]上述技术方案中,所述步骤四的(I)猴头菇子实体多糖的水解步骤中,分别称取步骤一得到的16种不同产地的猴头菇子实体多糖粗品8mg?12mg,分别配成8mg/mL?12mg/mL的多糖水溶液,然后将500yL的多糖水溶液置于5mL安培瓶中,并加入0.3mol/卜0.5mol/L三氟乙酸500yL,再充入氮气后用酒精喷灯封口,然后置于100°0120°C的烘箱中水解4h~6h,反应完全后,取出,放置冷却,再用氮气吹干;然后分别加入ImL的甲醇,搅拌后再用氮气吹干,重复上述加入甲醇并用氮气吹干的步骤三次以除去三氟乙酸;然后将残渣加入热水中溶解,并转移至2mL的比色管中,加水至刻度,摇匀后得到水解产物。
[0015]上述技术方案中,所述步骤四的(2)猴头菇子实体多糖水解产物的PMP衍生化反应步骤中,吸取400yL的上述第(I)步得到的水解产物,加入400yL 0.5M PMP的甲醇溶液和400yL 0.3M氢氧化钠溶液,混匀后,于60°080°C的水浴中反应60min?90min,冷却后加入400yL
0.3M盐酸中和,反应液在40 0C-60 0C下旋蒸至干,然后加入2mL水和ImL氯仿,漩涡振荡混匀,再离心处理;然后取上层水溶液,再往上层水溶液中加入氯仿,重复上述操作直至氯仿层无颜色为止,再将最后的水相用0.22μπι的微孔膜过滤后,得到PMP衍生化产物。
[0016]本发明与现有技术相比较,有益效果在于: (I)本发明提供的猴头菇子实体三维指纹图谱,由于大量研究证实,多糖类物质是猴头燕子实体中极其重要的功效成分,故用猴头燕子实体多糖成分作为研究对象具有代表性。而真菌多糖的分子量高达几万甚至几千万,它们的结构相近且糖苷键连接方式复杂多样,故很难像小分子那样进行直接进行色谱分离检测。本发明将猴头菇子实体多糖进行水解衍生后在反相HPLC上分离,分离度和峰形均较好,特征峰个数较多;并且利用了红外光谱(IR)和紫外光谱(UV)技术灵敏度较高,非糖物质干扰小的特点,从结构上把握了猴头菇多糖的质量情况及产地来源,并且为猴头菇产品的质量控制和真伪鉴别提供一种新的质量评价方法,即,该猴头菇子实体三维指纹图谱,对于猴头菇子实体的质量检测,具有易于判断真伪、评价优劣,且考察稳定性和一致性好的优点,并且,该猴头菇子实体三维指纹图谱对制定猴头菇相应的质量标准,开发猴头菇潜在的药用价值具有十分重要的意义。
[0017](2)本发明提供的猴头菇子实体三维指纹图谱,是运用多种检测方法建立了猴头菇子实体多糖的三维指纹图谱(包括HPLC、FTIR和UV指纹图谱),克服了现有检测技术和检测指标单一的缺点。
[0018](3)本发明提供的猴头菇子实体三维指纹图谱的构建方法,与现有质量评价技术相比,本构建方法得到的主要成分相关性良好,归属性强,构建方法重现性和稳定性好、精密度高;并且样品和混合标准品的特征色谱峰分离度较好,稳定性高,样品制备步骤简便,色谱条件易掌握和实现。
[0019](4)本发明提供的猴头菇子实体三维指纹图谱的构建方法,该构建方法操作方便,结果快速易得,并将三维指纹图谱技术辅助于统计学手段,综合分析数据,可全面监控原材料、成品以及半成品的质量,为猴头菇子实体的真伪鉴别和质量控制提供新的科学依据。
【附图说明】
[0020]图1是本发明的猴头菇子实体三维指纹图谱的FTIR标准指纹图谱。
[0021]图2是本发明的猴头菇子实体三维指纹图谱的UV标准指纹图谱。
[0022]图3是本发明的猴头菇子实体三维指纹图谱的HPLC标准指纹图谱。
【具体实施方式】
[0023]为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
[0024]实施例1。
[0025]猴头菇子实体三维指纹图谱,它由FTIR标准指纹图谱、UV标准指纹图谱和HPLC标准指纹图谱组成,并通过对16种不同产地猴头菇品种的子实体的多糖成分进行比较分析得出;
其中,见图1,FTIR标准指纹图谱中,猴头菇子实体多糖的特征吸收波长为3600cm—I3200cm—\3000cm—1?2800cm—\ 1600cm—1?1000cm—\800cm—1?500cm—S 并确定有 11 个共有特征吸收峰,其吸收波长λ—Hcnf1)分别为576.71、887.25、1056.99、1242.15、1404.17、1533.40、
1647.20、2933.72、3385.07、3749.61和3855.70;
其中,见图2,UV标准指纹图谱,是通过在200nm?600nm波长区间进行扫描得到的猴头菇子实体多糖的紫外全波长扫描光谱图,得出在200nm?220nm和260nm?280nm处有吸收,且在215nm处吸收值最大;
其中,见图3,HPLC标准指纹图谱中,确定有16个共有特征峰,其相对保留时间tR(以葡萄糖峰S13为参照峰)分别为0.135 min、0.422min、0.458 min、0.478 min、0.507 min、
0.536 min、0.597 min、0.610 min、0.626 min、0.651 min、0.691 min、0.954 min、1.000min、1.149 min、1.212 min和1.433 min0
[0026]其中,见图1,FTIR标准指纹图谱中,在波长为887.25cm—1处(2号峰)为β-端基差向异构的C-H变角振动吸收峰;1056.99cm—1处(3号峰)为醇羟基的C-O伸缩振动吸收峰;1242.15cm—1处(4号峰)为环上C-C键的骨架振动吸收峰;1404.17cm—1处(5号峰)为C-O伸缩振动吸收峰,表明有糖醛酸;1533.40cm—1处(6号峰)为N-H变角振动吸收峰;1647.20cm—1处(7号峰)为C=O伸缩振动吸收峰;2933.72cm—1处(8号峰)为烷基C-H伸缩振动吸收峰;3385.07cm—1处(9号峰)为O-H伸缩振动吸收峰,表明有氢键存在。
[0027]其中,见图3,HPLC标准指纹图谱中,I号峰、4号峰、8号峰、9号峰、13号峰、14号峰、15号峰、16号峰分别对应的成分为:果糖、甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖。
[0028]其中,见图3,HPLC标准指纹图谱中,相对峰面积占总峰面积百分比由高到低的特征峰依次为13号峰、14号峰和16号峰;
13号峰、14号峰和16号峰的相对峰面积范围分别为:36.761%?59.102%、15.001%?28.170%、3.840%?8.653%。
[0029]实施例2。
[0030]猴头菇子实体三维指纹图谱的构建方法,其特征在于:它包括以下步骤:
步骤一,猴头菇子实体多糖的提取:
分别称取16种不同产地的猴头菇子实体粉末2.5g于容器中,并加入50mL的水,然后于83°C的水浴中震荡5.5h,再冷却并离心处理,然后收集上清液并减压蒸发浓缩后置于透析袋中进行透析15h,再将透析物进行真空冷冻干燥,得到猴头菇子实体多糖粗品;
步骤二,猴头菇子实体多糖的FTIR指纹图谱的构建:
分别称取步骤一得到的16种不同产地的猴头菇子实体多糖粗品2.5mg,加入125mg的溴化钾,研磨后取样进行测定,检测波数为4000?400cm—S在此条件下得到16种不同产地的猴头菇子实体多糖的FTIR指纹图谱,并通过平均值法建立16种不同产地的猴头菇子实体多糖的FTIR标准指纹图谱;比较不同产地的猴头菇子实体多糖的FTIR标准指纹图谱,并确定有11个共有特征吸收峰,其吸收波长λ—Hcnf工)分别为576.71、887.25、1056.99、1242.15、
1404.17、1533.40、1647.20、2933.72、3385.07、3749.61和3855.70;
步骤三:猴头菇子实体多糖的UV指纹图谱的构建:
分别称取步骤一得到的16种不同产地的猴头菇子实体多糖粗品10mg,配成lOOyg/mL的多糖水溶液,于200nm?600nm波长区间进行扫描得到猴头菇子实体多糖紫外全波长扫描光谱图,并通过平均值法建立16种不同产地的猴头菇子实体多糖的UV标准指纹图谱,得出在200nm?220nm和260nm?280nm处有吸收,且在215nm处吸收值最大;
步骤四,猴头菇子实体多糖的HPLC指纹图谱的构建:
(I)猴头菇子实体多糖的水解:分别称取步骤一得到的16种不同