入液氮充分研磨至粉末状，迅速转移至步骤201中的离心 管中，于65 °C水浴裂解2h，期间振荡混匀3-5次；
[0042] 步骤203、水浴结束后，取出离心管冷却，于室温12000rpm离心12min;
[0043] 步骤204、离心后用移液枪将700μ1上清液转入1.5ml另一离心管中，加入700μ1氯 仿和异戊醇的混合溶液（氯仿和异戊醇体积比24:1)，轻轻颠倒混匀lOmin，于4°C下 12000rpm离心 lOmin;
[0044] 步骤205、重复2-3次步骤204，直至无白色沉淀层为止；
[0045] 步骤206、将上清液转入1.5ml再一离心管中，加入700μ1预冷的异丙醇，轻轻混匀 至出现透明絮状DNA沉淀，于4°C下lOOOOrpm离心6min，弃上清液；
[0046] 步骤207、在步骤206后的离心管中加入1000μ1预冷的体积百分比为75%的乙醇溶 液，洗涤沉淀2次，每次1 OOOOrpm离心6min，弃乙醇，室温下风干至乙醇完全挥发；
[0047] 步骤208、在步骤207后的离心管中加入500μ1 1M NaCl，充分溶解DNA后，加入2μ1 RNase(10mg/ml)，于37°C水浴lh;
[0048] 步骤209、在步骤208后的离心管中再加入lml无水乙醇，混匀后-20°C沉淀DNA 15h；
[0049] 步骤210、于4°C下8000rpm离心10min，弃上清液，体积百分比为75 %的乙醇溶液洗 涤DNA 2次，每次8000rpm离心6min，弃乙醇，室温风干至乙醇完全挥发；
[0050] 步骤211、再加入200μ1 TE缓冲液（10mM Tris-HCl、lmM EDTA，pH = 8.0)溶解DNA， DNA样品置于-20 °C保存备用。
[0051 ]第三实施例、引物的筛选 [0052] 1、确定目的基因片段
[0053]选取代表性柿品种（磨盘柿）及其他柿属植物（金枣柿、君迀子、浙江柿以及油柿） 材料的叶绿体总DNA样品；
[0054]将上述5份柿属植物材料的cpDNA进行测序，通过多序列比对，确定一个大于20bp 的插入/缺失目的基因片段；
[0055] 2、筛选引物
[0056] 根据上述目的基因片段设计引物，按照下述体系（如表2所示）和条件进行PCR扩 增：
[0057] 表2、PCR反应体系
[0058]
[0059] PCR反应条件为：
[0060]
[0061 ]上述方法获得的PCR产物通过Gelred染色的浓度为2.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测。 采用Bio-red公司凝胶成像系统观察并记录谱带。利用UniQ柱型回收试剂盒(上海生物工程 有限公司）回收纯化扩增产物，所得产物在自动测序仪上进行双向测序。
[0062]通过上述PCR扩增反应和重测序，最终筛选出一对可用于鉴别柿种和其他柿属植 物的特异性引物。引物信息如下：
[0063] 正向引物：5/-TCAAAGAGGGAGGTTTCT-3/，如SEQIDN0 :l所示；
[0064] 反向引物：5/-CCGTTATTCGGAGGTTCG-3/如SEQIDN0 :2所示。
[0065] 第四实施例、系统发育树的构建
[0066] 利用第三实施例中所述方法和筛选的引物对16份柿属植物材料进行PCR扩增反应 和重测序。
[0067]对15份柿属植物材料和待鉴别柿属植物材料-云南野毛柿所测得序列用Clustal X软件（Thompson，1997)进行对位排列，然后利用MEGA软件，使用邻近法（The Neighbor-Jioning，NJ)建立起始树，再采用最大似然法(Maximum Composite Likelihood，ML)找到最 似然树，并利用bootstrap(1000次重复)检验各分支的置信度。
[0068]图1的结果表明：经上述方法鉴定，云南野毛柿为其他柿属植物，即用1对引物就可 将其鉴别为其他柿属植物。
【主权项】
1. 一种柿cpDNA分子标记的扩增引物，其特征在于，如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所 /J、- O2. -种权利要求1所述柿cpDNA分子标记的扩增引物的筛选方法，其特征在于，包括如 下步骤:对标准种质的cpDNA测序;对目标种质的cpDNA测序，目标种质即为待鉴定的种质； 将W上两个步骤得到的测序结果进行比对，获得差异区域并设计引物;经过PCR扩增、纯化 和重测序后，筛选到能够有效鉴别柿种和其他柿属植物的扩增引物。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述差异区域为大于20bp的片段。4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述标准种质的数量为3个或3个W上。5. -种利用cpDNA分子标记进行柿种质鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤:利用 分子标记引物PCR扩增标准种质；利用分子标记引物PCR扩增目标种质，目标种质即为待鉴 定的种质；将W上两个步骤得到的扩增结果进行比对，根据比对结果是否一致进行种质鉴 定，所用分子标记的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述利用分子标记引物PCR扩增步骤前还 包括提取标准种质和目标种质的叶绿体全基因组DNA。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述提取标准种质和目标种质的叶绿体全 基因组DNA包括如下步骤： 步骤1、在1.5ml离屯、管中加入80化1 CTAB DNA提取缓冲液，所述提取缓冲液包括抑8.0 IOOmM Tris-肥U1.4M NaQ和抑8.0 20mM EDTA，再加入30iUe-琉基乙醇，混匀后置于65°C 水浴预热； 步骤2、取0.3g叶片，加入液氮充分研磨至粉末状，迅速转移至步骤1中的离屯、管中，于 65 °C水浴裂解化，期间振荡混匀3-5次； 步骤3、水浴结束后，取出离屯、管冷却，于室溫120(K)rpm离屯、12min; 步骤4、离屯、后用移液枪将70化1上清液转入1.5ml另一离屯、管中，加入70化1氯仿和异 戊醇的混合溶液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24 : 1，轻轻颠倒混匀IOmin，于4°C下 12000巧m 离屯、1 Omin; 步骤5、重复2-3次步骤4，直至无白色沉淀层为止； 步骤6、将上清液转入1.5ml再一离屯、管中，加入70化1预冷的异丙醇，轻轻混匀至出现 透明絮状DNA沉淀，于4 °C下1000化pm离屯、6min，弃上清液； 步骤7、在步骤6后的离屯、管中加入1000 iil预冷的体积百分比为75 %的乙醇溶液，洗涂 沉淀2次，每次1000化pm离屯、6min，弃乙醇，室溫下风干至乙醇完全挥发； 步骤8、在步骤7后的离屯、管中加入50化1 IM NaCl,充分溶解DNA后，加入化1 lOmg/ml RNase，于37°C水浴化； 步骤9、在步骤8后的离屯、管中再加入1ml无水乙醇，混匀后-20°C沉淀DNA 15h; 步骤10、于4 °C下8000巧m离屯、IOmin，弃上清液，体积百分比为75 %的乙醇溶液洗涂DNA 2次，每次8000巧m离屯、6min，弃乙醇，室溫风干至乙醇完全挥发； 步骤11、再加入20化1 TE缓冲液成分溶解DNA，DNA样品置于-20°C保存备用。8. 根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增条件如下： 所述PCR扩增反应体系如下： 组分 .加入量/'JiL kcmix HIFI DNA 牺 0.3 IOX BuiTcr 3.0 4NTP XS DMSO 0.5 正向引物 1.5 反向引物 1.5; 巧 DNA 2.0 无菌无RNA酶巧2〇 巧..5 Total volume 30； 所述PCR扩增程序为：（1)94°C预变性3min; (2)94°C变性45s; (3)52°C退火lmin; (4)72 °C延伸50s; (5)返回步骤(2)，重复35个循环；（6) 4°C保存。9. 一种柿遗传资源多样性的分析方法，为分子标记扩增分析法，其特征在于，利用权利 要求1所述柿cpDNA分子标记的扩增引物进行扩增分析。10. -种包含权利要求1所述柿cpDNA分子标记的扩增引物的检测试剂盒。
【专利摘要】本发明涉及一种利用cpDNA分子标记进行柿种质鉴定的方法，所述柿cpDNA分子标记的扩增引物如SEQ？ID？NO：1或SEQ？ID？NO：2所示。所述利用cpDNA分子标记进行柿种质鉴定的方法包括如下步骤：利用分子标记引物PCR扩增标准种质；利用分子标记引物PCR扩增目标种质，目标种质即为待鉴定的种质；将以上两个步骤得到的扩增结果进行比对，根据比对结果是否一致进行种质鉴定，所用分子标记的正向引物和反向引物分别如SEQ？ID？NO：1和SEQ？ID？NO：2所示。本发明操作简单、重现性好、效率高，可以有效的鉴别未知材料为柿种或为其他柿属植物。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105648105
【申请号】
【发明人】傅建敏, 乌云塔娜, 韩卫娟, 孙鹏, 刁松锋, 张嘉嘉, 罗颖, 张悦
【申请人】国家林业局泡桐研究开发中心
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年4月13日