利用cpDNA分子标记进行柿种质鉴定的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种柿种质鉴定的方法，特别是涉及一种利用cpDNA分子标记进行柿 种质鉴定的方法。
【背景技术】
[0002]全世界的柿属(Diospyros spp.)植物共190种左右，其中有乔木、灌木，有落叶的 也有常绿性的，大部分分布在热带和亚热带。我国柿属植物资源丰富，经济利用价值较高， 主要分布在西南和华南地区。
[0003] 左大勋（1984)等报道的我国柿属植物有58种和变种（型）（不包括国外引入种），其 中特有种27种。中文版《中国植物志》（1987)中记载，我国有64种和变种(型），其中有57种，6 变种，1变型，1栽培种。王仁梓（1988)等报道我国柿属植物共有66种，包括从国外引入种。英 文版《中国植物志》（1996)虽也记载我国柿属植物有64种和变种(60种、4变种），但其内容却 与中文版《中国植物志》不尽一致。张鸿龄（1994)、罗正荣（1996)以及杨勇（2005)等报道均 和中文版《中国植物志》一致。发明人根据《中国植物志》（中英文版）以及各地方《植物志》或 《树木志》共计32份资料，统计可知我国柿属植物共有78种和变种（型）（68种、8变种、2变 型）。此外，我国广袤的南方山区尤其是西南和华南山区存在着大量的野生柿属资源，这些 野生资源的分类地位不明确，为柿(品）种还是其他柿属植物需要更进一步鉴别。
[0004] 由此可见，我国柿属植物资源种类记载不一，地方植物志与国家植物志对柿属植 物的统计不尽一致，许多柿属植物资源分类地位不明确，这对我国柿属植物资源的收集、保 存以及利用造成一定影响，进而影响柿属植物杂交育种工作的开展。
[0005] 目前主要是从形态学和分子生物学进行植物资源鉴别分类，传统的形态鉴别法依 赖于表型差异，而表型的形态性状却受气候、环境、营养状态以及生物期等多种因素影响， 且形态鉴别法工作量大、鉴别周期长、成本高。在木本植物的鉴别分类研究中，多应用RAro、 SSR、AFLP等分子标记技术，但是这些标记大多是采用无全基因组序列信息的技术开发得 到，虽具有一定的应用价值，但随机性强、稳定性差。并且由于柿属植物资源倍性复杂，其核 基因组结构和序列也是复杂多变，而相较于核基因，叶绿体基因组结构和序列非常保守，但 至今未发现关于利用cpDNA分子标记进行柿属植物资源种间系统进化和亲缘关系研究的报 道。
【发明内容】
[0006] 本发明为了解决上述问题而提供了一种利用cpDNA分子标记进行柿种质鉴定的方 法，该方法所利用的cpRNA分子标记鉴别能力强且重现性好，能够有效的鉴别未知资源为柿 种或为其他柿属植物，同时为我国柿属植物资源的鉴别、遗传进化分析及亲缘关系分析提 供重要技术支持，对我国柿属植物杂交育种及开发利用具有重大的意义。
[0007] 本发明提供了一种柿cpDNA分子标记的扩增引物，如SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2 所示。
[0008] 本发明还提供了一种所述柿cpDNA分子标记的扩增引物的筛选方法，包括如下步 骤:对标准种质的cpDNA测序;对目标种质的cpDNA测序，目标种质即为待鉴定的种质；将以 上两个步骤得到的测序结果进行比对，获得差异区域并设计引物;经过PCR扩增、纯化和重 测序后，筛选到能够有效鉴别柿种和其他柿属植物的扩增引物。
[0009] 进一步地，所述差异区域为大于20bp的片段。
[0010] 更进一步地，所述标准种质的数量为3个或3个以上。
[0011]本发明还提供了一种利用cpDNA分子标记进行柿种质鉴定的方法，包括如下步骤： 利用分子标记引物PCR扩增标准种质；利用分子标记引物PCR扩增目标种质，目标种质即为 待鉴定的种质；将以上两个步骤得到的扩增结果进行比对，根据比对结果是否一致进行种 质鉴定，所用分子标记的正向引物和反向引物分别如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示。
[0012] 所述利用分子标记引物PCR扩增步骤前还包括提取标准种质和目标种质的叶绿体 全基因组DNA。
[0013] 进一步地，所述提取标准种质和目标种质的叶绿体全基因组DNA包括如下步骤：
[0014] 步骤1、在1.5ml离心管中加入800μ1 CTAB DNA提取缓冲液，所述提取缓冲液包括 pH8.0 lOOmM Tris-HC1、1.4M NaCl和pH8.0 20mM EDTA，再加入30μ1β-巯基乙醇，混匀后置 于65 °C水浴预热；
[0015]步骤2、取0.3g叶片，加入液氮充分研磨至粉末状，迅速转移至步骤1中的离心管 中，于65°C水浴裂解2h，期间振荡混匀3-5次；
[0016] 步骤3、水浴结束后，取出离心管冷却，于室温12000rpm离心12min;
[0017] 步骤4、离心后用移液枪将700μ1上清液转入1.5ml另一离心管中，加入700μ1氯仿 和异戊醇的混合溶液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，轻轻颠倒混匀lOmin，于4°C下 12000rpm离心 lOmin;
[0018] 步骤5、重复2-3次步骤4，直至无白色沉淀层为止；
[0019] 步骤6、将上清液转入1.5ml再一离心管中，加入700μ1预冷的异丙醇，轻轻混匀至 出现透明絮状DNA沉淀，于4°C下lOOOOrpm离心6min，弃上清液；
[0020] 步骤7、在步骤6后的离心管中加入ΙΟΟΟμΙ预冷的体积百分比为75%的乙醇溶液， 洗涤沉淀2次，每次lOOOOrpm离心6min，弃乙醇，室温下风干至乙醇完全挥发；
[0021] 步骤8、在步骤7后的离心管中加入500μ1 1M NaCl，充分溶解DNA后，加入2μ1 10mg/mlRNase，于37°C 水浴 lh;
[0022] 步骤9、在步骤8后离心管中再加入lml无水乙醇，混匀后-20°C沉淀DNA 15h;
[0023] 步骤10、于4 °C下8000rpm离心10min，弃上清液，体积百分比为75 %的乙醇溶液洗 涤DNA 2次，每次8000rpm离心6min，弃乙醇，室温风干至乙醇完全挥发；
[0024] 步骤11、再加入200μ1 TE缓冲液成分溶解DNA，DNA样品置于-20°C保存备用。
[0025] 优选地，所述PCR扩增条件如下：
[0026] 所述PCR扩增反应体系如下： .组分 加入量/]iL kcmix H1FI DNA iVj 0.3 10X BulTcr 3,0 dNTP 2,5： DMSO 0.5
[0027] 正向引物 1,5 反向引物 1.5: cpDNA 2,0 无菌无RNA酶H20 19.5 Total volume 30；
[0028] 所述PCR扩增程序为：（1)94°C预变性3min;(2)94°C变性45s;(3)52°C退火lmin; (4)72°C延伸5〇 8;(5)返回步骤(2)，重复35个循环；（6)4°(：保存。
[0029] 本发明还提供了一种柿遗传资源多样性的分析方法，为分子标记扩增分析法，利 用所述柿cpDNA分子标记的扩增引物进行扩增分析。
[0030] 本发明还提供了一种包含所述柿cpDNA分子标记的扩增引物的检测试剂盒。
[0031] 本发明通过对5份柿属植物材料的叶绿体全基因组测序后比对，确定差异区域并 设计引物，经过PCR扩增、纯化和重测序，筛选到1对可用于鉴别柿种和其他柿属植物的特异 性引物，所述特异性引物可以有效的鉴别未知材料为柿种或为其他柿属植物。该方法具有 操作简单、重现性好、效率高等特点，对研究柿种间系统发育以及柿新种的鉴别提供重要的 技术手段，也为我国柿属植物资源的鉴别、遗传进化分析及亲缘关系分析提供重要技术支 持，对我国柿属植物杂交育种及开发利用具有重大的意义。
【附图说明】
[0032]图1为本发明利用cpDNA分子标记进行柿种质鉴定的方法中鉴别云南野毛柿为其 他柿属植物的系统发育树图。
【具体实施方式】
[0033]下面通过具体实施例进一步说明本发明利用cpDNA分子标记进行柿种质鉴定的方 法的技术方案。
[0034]第一实施例、柿属植物材料的获得
[0035]从中国林业科学研究院经济林研发中心柿种质资源圃采集了 15份柿属植物材料， 从中国科学院西双版纳植物园采集1份待鉴别柿属植物材料-云南野毛柿(学名D.spp.)，从 目前的文献记载和传统形态分类学无法鉴别云南野毛柿为柿种或为其他柿属植物，来自中 国林科院的15份样品具体信息如表1所示。
[0036]表1、15个柿属植物材料的具体信息
[0037]
[0038] 第二实施例、柿属植物材料基因组DNA的提取
[0039]采用改良的CTAB法从上述16份柿属植物材料样品的叶片中提取叶绿体全基因组 DNA(cpDNA)，具体方法如下：
[0040] 步骤201、在1.5ml离心管中加入800μ1 CTAB DNA提取缓冲液，所述提取缓冲液包 括 100mM Tris-HCl(pH 8·0)、1·4Μ NaCl和20mM EDTA(pH 8.0)，再加入30μ1β-巯基乙醇，混 匀后置于65°C水浴预热；
[00411 步骤202、取0.3g叶片，加