NCs的紫外-可见特征吸收峰(图1B)与其最佳激发波长(图1A曲线c)的位置一致，均为340 nm。在紫外灯照射下，含有microRNA-21的样品呈现出明亮的红色荧光，而未含有microRNA-21的样品则无色(图1B内插图)。由以上结果可见，microRNA-21与CuNCs能否生成直接相关，据此可建立基于Cu NCs荧光的mi croRNA-21定量分析方法。
[0016]采用透射电子显微镜和原子力显微镜对制备Cu NCs进行形貌表征。由图2A可见，原位生成的Cu NCs是球形，平均粒径约3 nm。该结果与原子力显微镜中的Cu NCs的高度相符合，由图2B可见，Cu NCs周围紧紧地包裹着聚尿嘧啶碱基序列，Cu NCs顺着尿嘧啶延伸的方向生长。
[0017]我们考察了荧光发射光谱强度随着microRNA-21浓度的变化规律。由图3A可见，CuNCs的荧光强度随microRNA-21浓度的增加而增强，在microRNA-21浓度为I pM到I nM范围内，Cu NCs的荧光强度与microRNA-21浓度的对数呈线性关系(图3B)，对microRNA-21的检测限为100 fMo
[0018]为了评估本方法对microRNA-21检测的特异性，我们开展了一系列对照实验，包括米用两种microRNA(mi croRNA-210和microRNA-141)和单喊基错配(SM)mi croRNA-21为阴性对照，以及不含mi croRNA-21的样品为空白对照(blank)，结果如图4A所示。结果表明，microRNA-210和microRNA-141存在时的荧光强度与空白对照的荧光强度相比没有显著增加;单碱基错配mi croRNA-21存在时的荧光强度与空白对照的荧光强度相比有较小增强;然而，完全互补(PM)microRNA-21存在时的荧光强度与空白对照的荧光强度相比显著增强。由此可见，本方法可以区别完全互补和非互补的microRNA，即使它们只有一个碱基的差异也能区别出来，具有良好的特异性。
[0019]为了探讨本方法在复杂生物基质中定量检测microRNA的可行性，我们将本方法应用于定量检测从人类乳腺癌细胞(MCF-7)和人类肺癌表皮细胞(A549)提取的细胞溶解产物中mi croRNA-21的表达含量。由图4B可见，A549细胞溶解产物中的荧光强度比空白对照的荧光强度有所增加，表明在A549肺癌细胞中含有少量mi croRNA-21。而MCF-7细胞溶解产物中的荧光强度与空白对照的荧光强度相比显著增强，表明MCF-7乳腺癌细胞中mi croRNA-21的含量比较高。由紫外灯下MCF-7和A549细胞溶解产物的照片可见，在紫外灯的照射下，反应后，MCF-7细胞溶解产物中发出很强的红色荧光，而A549细胞溶解产物中的红色荧光却很轻微。以上结果表明，本方法可用于细胞溶解产物等复杂生物样品中microRNA的定量分析，具有广泛的应用前景。
[0020]实施例2
根据实施例1的研究过程，确定mi croRNA检测方法。
[0021](I)双聚合酶延伸尿嘧啶序列:将已知含量的microRNA与模板DNA(pDNA)混合，75°〇退火杂交15 min后慢慢冷却至室温，加入含聚合酶Klenow片段(KFexcT)、脱氧尿啼啶三磷酸核苷和末端脱氧核苷酸转移酶(TdTase)的缓冲溶液，在35 ° C水浴中反应4 h，制成聚尿嘧啶碱基序列； (2)合成焚光铜纳米簇:将抗坏血酸盐(ascorbate)加入到步骤(I)的聚尿啼啶碱基序列溶液中，再加入CuCl2，室温下反应1min，制成以聚尿嘧啶碱基序列为模板的红色荧光铜纳米簇，得到含红色荧光铜纳米簇的溶液；
(3)采用荧光分光光度计标定microRNA浓度与铜纳米簇红色荧光强度的标准关系曲线；
(4)将待测样品与模板DNA(pDNA)混合，75°C退火杂交15 min后慢慢冷却至室温，加入含聚合酶Klenow片段(KFexcT)、脱氧尿啼啶三磷酸核苷和末端脱氧核苷酸转移酶的缓冲溶液，在35 ° C水浴中反应4 h，制成聚尿嘧啶碱基序列；
(5)将抗坏血酸钠加入到步骤(4)的聚尿嘧啶碱基序列溶液中，再加入CuCl2,室温下反应lOmin，制成以聚尿嘧啶碱基序列为模板的红色荧光铜纳米簇，得到含红色荧光铜纳米簇的溶液;采用荧光分光光度计测定含红色荧光铜纳米簇的溶液的红色荧光强度，所得红色荧光强度结果与标准关系曲线对比，计算得出microRNA浓度。
【主权项】
1.一种microRNA检测方法，其特征在于步骤如下: (1)双聚合酶延伸尿嘧啶序列:将已知含量的microRNA与模板DNA混合，75°C退火杂交.15 min后慢慢冷却至室温，加入含聚合酶Klenow片段、脱氧尿啼啶三磷酸核苷和末端脱氧核苷酸转移酶的缓冲溶液，在35 °C水浴中反应4 h，制成聚尿嘧啶碱基序列； (2)合成荧光铜纳米簇:将抗坏血酸盐加入到步骤(I)的聚尿嘧啶碱基序列溶液中，再加入C11CI2，室温下反应1min，制成以聚尿啼啶碱基序列为模板的红色焚光铜纳米簇，得到含红色荧光铜纳米簇的溶液； (3)采用荧光分光光度计标定microRNA浓度与铜纳米簇红色荧光强度的标准关系曲线； (4)将待测样品与模板DNA混合，75℃退火杂交15 min后慢慢冷却至室温，加入含聚合酶Klenow片段、脱氧尿嘧啶三磷酸核苷和末端脱氧核苷酸转移酶的缓冲溶液，在35 °C水浴中反应4 h，制成聚尿嘧啶碱基序列； (5)将抗坏血酸钠加入到步骤(4)的聚尿嘧啶碱基序列溶液中，再加入CuCl2,室温下反应lOmin，制成以聚尿嘧啶碱基序列为模板的红色荧光铜纳米簇，得到含红色荧光铜纳米簇的溶液;采用荧光分光光度计测定含红色荧光铜纳米簇的溶液的红色荧光强度，所得红色荧光强度结果与标准关系曲线对比，计算得出microRNA浓度。
【专利摘要】本发明公开了一种microRNA检测方法，属于光学生物传感技术领域。将待测样品与模板DNA混合，退火杂交，加入含聚合酶Klenow片段、脱氧尿嘧啶三磷酸核苷和末端脱氧核苷酸转移酶的缓冲溶液，在35℃水浴中反应4h，制成聚尿嘧啶碱基序列；将抗坏血酸钠加入到步骤（4）的聚尿嘧啶碱基序列溶液中，再加入CuCl2，室温下反应10min，制成以聚尿嘧啶碱基序列为模板的红色荧光铜纳米簇，得到含红色荧光铜纳米簇的溶液；采用荧光分光光度计测定含红色荧光铜纳米簇的溶液的红色荧光强度，所得红色荧光强度结果与标准关系曲线对比，计算得出microRNA浓度。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105648098
【申请号】
【发明人】吴滨
【申请人】吴滨
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月23日