一种microRNA检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种microRNA检测方法，属于光学生物传感技术领域。
【背景技术】
[0002]成熟的microRNA是一类单链、非编码蛋白、短的内源性RNA(长度约19-23个核苷酸XMicroRNA作为重要的基因表达的后转录调控因子，可以调节信使核糖核酸的分裂或翻译抑制。MicroRNA在许多生物进程中起着重要作用，这不仅包括癌症的早期诊断和预后指标，还包括介入治疗以及癌症药物的发现。所以，开发灵敏度高且选择性好的microRNA检测方法非常必要。
[0003]体外聚合核苷酸因具有显著的信号放大能力，作为一个强有力的工具广泛应用于生物分析中。在研究microRNA的检测方法方面，体外聚合核苷酸显示出其巨大的应用潜能，如，聚合酶链反应、滚环扩增反应以及链置换反应等。大多数传感器基于荧光分析法，需使用荧光基团或染料标记的探针作为信号源。但是设计合成这些信号源通常操作复杂或昂贵或需要大量、多步、费时的实验。更重要的是，这些信号源一般有较强的非特异性吸附，使得制备的传感器对环境非常敏感，同时也降低了灵敏度。近年来，做为代替荧光基团的理想的候选者，以DNA为模板合成的荧光铜纳米粒子或铜纳米簇(Cu NCs)引起人们越来越多的关注。由于纳米簇具有非常小的尺寸，较弱的毒性，优秀的光学性质和良好的水溶性与生物相容性，在生物化学应用方面显示出巨大的潜力。然而，迄今为止，利用体外聚合核苷酸扩增反应和以单链DNA为模板合成Cu NCs相结合用于microRNA的检测技术尚未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供了一种microRNA检测方法，该方法对microRNA的检测具有背景低、灵敏和简单快速的优点。
[0005]本发明是这样来实现的，一种microRNA检测方法，其特征在于步骤如下:
(1)双聚合酶延伸尿嘧啶序列:将已知含量的microRNA与模板DNA混合，75°(:退火杂交15 min后慢慢冷却至室温，加入含聚合酶Klenow片段、脱氧尿啼啶三磷酸核苷和末端脱氧核苷酸转移酶的缓冲溶液，在35 °C水浴中反应4 h，制成聚尿嘧啶碱基序列；
(2)合成荧光铜纳米簇:将抗坏血酸盐加入到步骤(I)的聚尿嘧啶碱基序列溶液中，再加入C11CI2，室温下反应1min，制成以聚尿啼啶碱基序列为模板的红色焚光铜纳米簇，得到含红色荧光铜纳米簇的溶液；
(3)采用荧光分光光度计标定microRNA浓度与铜纳米簇红色荧光强度的标准关系曲线；
(4)将待测样品与模板DNA混合，75°(:退火杂交15 min后慢慢冷却至室温，加入含聚合酶Klenow片段、脱氧尿嘧啶三磷酸核苷和末端脱氧核苷酸转移酶的缓冲溶液，在35 °C水浴中反应4 h，制成聚尿嘧啶碱基序列；
(5)将抗坏血酸钠加入到步骤(4)的聚尿嘧啶碱基序列溶液中，再加入CuCl2,室温下反应lOmin，制成以聚尿嘧啶碱基序列为模板的红色荧光铜纳米簇，得到含红色荧光铜纳米簇的溶液;采用荧光分光光度计测定含红色荧光铜纳米簇的溶液的红色荧光强度，所得红色荧光强度结果与标准关系曲线对比，计算得出microRNA浓度。
[0006]检测原理为:当microRNA存在时，引物microRNA与模板DNA杂交形成引物-模板复合物;加入聚合酶Klenow片段使其绑定在引物-模板复合物中引物的3羟基末端，催化引物延伸反应，生成与模板DNA互补的短DNA序列;加入末端脱氧核苷酸转移酶，将脱氧尿嘧啶三磷酸核苷添加到新生成的短DNA序列的3’-羟基末端，催化脱氧尿嘧啶三磷酸核苷沿着短DNA序列的5’端向3’端延伸而形成聚尿嘧啶碱基序列；加入CuCl2和抗坏血酸钠，以聚尿嘧啶碱基序列为模板原位生成铜纳米簇，铜纳米簇的荧光强度随microRNA浓度的增加而增强。
[0007]本发明的技术效果是:本发明利用聚合酶Klenow片段和脱氧核苷酸转移酶对脱氧尿嘧啶三磷酸核苷在microRNA-DNA复合物上的延伸作用，形成聚尿嘧啶碱基序列，加入CuCl2和抗坏血酸钠后原位生成以聚尿嘧啶碱基序列为模板的铜纳米簇，铜纳米簇的荧光强度与microRNA浓度呈正相关，据此实现对microRNA的检测，该方法具有背景低、灵敏和简单快速的优点。
【附图说明】
[0008]图1是(A)荧光发射和激发光谱，(a)含和(b)不含microRNA-21的发射光谱，(C)含microRNA-21的最大激发光谱。内插图:凝胶电泳图。条带M: ladder marker;条带O和I分别是(0)不含和(I)含microRNA-21的样品。(B)紫外-可见吸收光谱，内插图为(I)不含和(2)含m i croRNA-21的样品在紫外灯照射下的照片。
[0009]图2是CuNCs的(A)透射电子显微镜图和(B)原子力显微镜图。
[0010]图3是(A)不同浓度microRNA-21(0，l，2，5，10，20，50，100，200，500，1000pM)存在时的荧光光谱图。(B)荧光强度与microRNA-21浓度的关系曲线，内插图为荧光强度与m i croRNA-21浓度的对数关系曲线。
[0011]图4是(A)分析方法的特异性。(B)实际样品检测，内插图为紫外灯下得到的相对应的细胞溶解产物的照片。
【具体实施方式】
[0012]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此。
[0013]实施例1
(I)双聚合酶延伸尿嘧啶序列:将microRNA与模板DNA(pDNA)混合，75 °(:退火杂交15min后慢慢冷却至室温，加入含聚合酶Klenow片段(KFexcT)、脱氧尿啼啶三磷酸核苷和末端脱氧核苷酸转移酶(的缓冲溶液，在35 °C水浴中反应4 h，制成聚尿嘧啶碱基序列。
[0014](2)合成荧光铜纳米簇:将抗坏血酸盐加入到步骤(I)的聚尿嘧啶碱基序列溶液中，再加入C11CI2，室温下反应1min，制成以聚尿啼啶碱基序列为模板的红色焚光铜纳米簇。
[0015]由图1A可见，当存在microRNA-21时，以双聚合酶延伸尿嘧啶形成的聚尿嘧啶碱基序列为模板原位合成的Cu NCs在600 nm处有强的焚光发射峰(曲线a)，最佳激发波长为340nm(曲线C)。然而，在没有microRNA-21存在时，则没有明显的荧光发射峰出现(曲线b)，表明，在没有生成Cu NCs。采用琼脂糖凝胶电泳对双聚合酶延伸尿嘧啶的反应产物进行分析(内插图)，当存在mi croRNA-21时，反应产物呈现出明显的长拖尾现象(条带I)，表明反应合成了高分子量的聚尿嘧啶碱基结构;而当没有microRNA-21存在时，则未获得高分子量的产物(如条带O所示XCu