[0032] 实施例1试剂盒的制备 采集176份动物粪便样品（鸡，鸭，人，狗，猪，牛），经高通量测序得到196038条细菌 16SrDNA序列。通过将所得序列进行数据库比对，挑选出所有奠便样品中Faecalibacterium 菌16SrDNA基因序列，并做物种间的详细对比，设计出一对可特异鉴定狗粪便的DNA引物 ED-1 (扩增长度：145bp)和一对Faecal ibacterium菌16SrDNA通用引物FUP(扩增长度： 237bp)，引物的具体序列如下表1所示： 表1
采用现有技术合成上述引物对ED-1和引物对FUP，然后直接将上述引物对ED-1装配入 试剂盒，或者上述引物对Η)-1和引物对FUP-起装配入试剂盒。
[0033]也就是说，本发明的试剂盒，含有引物对ED-1。优选地，还可含有引物对FUP。进一 步，所述试剂盒还可以含有2XPower Taq PCR Master Mix等试剂。
[0034] 实施例2试剂盒的使用 采用实施例1的试剂盒，对鸡，鸭，人，狗，猪，牛这六个物种的含Faecal ibacterium菌奠 便样品进行检测。
[0035] 具体检测步骤如下： (1) 提取样品基因组DNA: 取鸡，鸭，人，狗，猪，牛这六个物种的的新鲜Faecalibacterium奠便样品，分别编号为 1、2、3、4、5、6,每个物种设置4个重复;采用现有DNA提取试剂盒(例如:M0-BI0 PowerSoil ? DNA Isolation kit)分别提取样品基因组DNA; (2) PCR扩增反应： 取步骤⑴中的各样品基因组DNA，分别以引物对ED-1、引物对FUP作为引物，进行PCR扩 增。
[0036] PCR扩增反应液如下表2或表3所示： 表2
然后进行PCR扩增反应，PCR扩增的程序如下： ED-1:预变性96°C/300s;变性96°C/30s，退火64°C/30s，延伸72°C/30s，32次循环。
[0037] FUP:预变性95°C/300s;变性94°C/30s，退火60°C/30s，延伸72°C/30s，32次循环。
[0038] (3)特异性验证： 取步骤(2)中所得六个物种的扩增产物5ul用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果如图1A 所示，引物对ED-l能够扩增狗奠便中Faecalibacterium菌并产生相应条带，但是引物对ED-1不能够扩增鸡，鸭，人，猪和牛奠便中的Faecalibacterium菌因而不能够产生相应的条带 说明，引物对ED-1能够特异性扩增狗奠便中Faecalibacterium菌，具有100%的特异性。如图 1B所示，而通用引物对FUP对六个物种奠便中Faecal ibacterium菌都能扩增并产生相应的 条带，因此可采用通用引物对FUP作为对照，分别采用引物对ED-1和通用引物对FUP进行PCR 扩增，均能产生条带的样品，才判定为狗奠便Faecalibacterium菌阳性，从而提高检测的准 确率。
[0039] (4)灵敏度验证： 如图2所示的定量PCR标准曲线，经计算，引物对ED-1的最低检测限（LOQs)为3.90拷贝 数/反应，充分表明，引物对Η)-1具有很高的灵敏度。
[0040] (5)阳性率验证： 选取50个狗奠便Faecalibacterium菌阳性样品，按照步骤（1)和(2)中的方法提取样品 基因组DNA并进行PCR扩增，扩增产物5ul用2%琼脂糖凝胶电泳进行分析，部分结果如图3所 示，50个阳性样品中有44个样品可以通过引物对ED-1进行PCR扩增并可看到明显目的条带， 其阳性率为88%，说明引物对ED-1具有较好的稳定性。
[0041] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种狗粪便污染检测引物对，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序 列如SEQ ID NO.1所示;所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2. 根据权利要求1所述的狗粪便污染检测引物对在制备狗粪便检测试剂或检测试剂盒 中的用途。3. -种狗粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求1所述狗粪便 污染检测引物对。4. 根据权利要求3所述的狗粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有对照 引物对，所述对照引物对含有正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述反向引物的如SEQ ID NO.4所示。5. 根据权利要求3所述的狗粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有2 X Power Taq PCR Master Mix〇6. 根据权利要求3所述的狗粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有阳性 对照，阳性对照含有Faecalibacterium菌保守序列。7. 根据权利要求3所述的狗粪便污染检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有阴 性对照，阴性对照可为各种不含有Faecalibacterium菌的溶液。8. -种采用如权利要求3~7任一权利要求所述狗粪便污染检测试剂盒进行狗粪便污染 检测的方法，包括如下步骤： 提取样品基因组DNA; 加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR扩增反应液的PCR管 中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管； PCR扩增:反应管置于PCR仪上，设置反应参数，进行PCR扩增； PCR反应结束后，采用扩增产物分析结果。9. 如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，各反应管中，PCR扩增反应液 的体积为15 ul，含样品基因组DNA lul，正向引物（10uM/L)0.5ul，反向引物（10uM/L) 0.5ul，2XPower Taq PCR Master Mix 7.5ul，无菌水补足至 15 ul〇10. 如权利要求3~7任一权利要求所述试剂盒在制备狗粪便污染检测产品中的用途。
【专利摘要】本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种狗粪便污染检测试剂盒及其制备与应用。本发明所述试剂盒含有前述狗粪便污染检测引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。所述试剂盒对狗粪便污染检测特异性高达100%，最低检测限（LOQs）为3.90拷贝数/反应，阳性率高达88%。采用所述引物对及试剂盒能够快速判定水体是否被污染，并定位污染源。
【IPC分类】C12R1/01, C12Q1/04, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105648097
【申请号】
【发明人】段传人, 张坤, 崔亚敏, 孙达, 张宝云, 王媛, 罗美玲
【申请人】重庆大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月22日