一种狗粪便污染检测试剂盒及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种狗粪便污染检测试剂盒及其制备与 应用。
[0002]
【背景技术】
[0003] 狗是人类饲养率最高的宠物，不论城市，农村到处都可见狗的身影，然而狗粪便污 染却少有人研究。一些发展中国家，如印度，受其经济基础所限，很多地区的饮用水均为未 处理的地表水或湖泊水，狗在印度作为饲养率最高的动物之一，其粪便造成的饮用水污染 对人体的健康造成很大危害。目前，水质监测的生物指标为大肠杆菌数和细菌总数，然而这 些指标只能反映水体状况，无法实时监控水体污染，也无法定位水体污染源。
[0004] 因此，能够准确检测狗粪便污染是当务之急。
[0005]
【发明内容】
[0006] 针对现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种狗粪便污染检测试剂 盒及其制备与应用。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 本发明的第一方面，提供一种狗粪便污染检测引物对，包括正向引物和反向引物，所述 正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，具体为:CAGGCGGACTCTTAAGTC;所述反向引物 的核苷酸序列如SEQ ID从).2所示，具体为:60641^1^^61'1'(：1'11^1'。
[0008] 本发明的第二方面，提供了前述狗粪便污染检测引物对在制备狗粪便检测试剂或 检测试剂盒中的用途。
[0009] 本发明的第三方面，提供一种狗粪便污染检测试剂盒，所述试剂盒含有前述狗粪 便污染检测引物对。
[0010] 优选地，所述试剂盒还含有对照引物对，所述对照引物对含有正向引物和反向引 物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，具体为:CTAACTACGTGCCAGCAGCC;所述 反向引物的如SEQ ID从).4所示，具体为:60：1'1^60^0^^^611'0：。
[0011 ]本发明的试剂盒采用高灵敏性的PCR技术来进行狗奠便Faecalibacterium菌的检 测，采用所述狗粪便污染检测引物对进行PCR扩增，根据扩增情况可分析来判断狗粪便 Faecal ibacterium菌感染情况。因此，引物对的设计是本发明试剂盒的关键。
[0012]基于本发明所述试剂盒采用的是PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包 括其他一些PCR所需要的常规试剂，如:Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs等常用PCR反应 试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此 具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装 配入试剂盒。
[0013] 所述PCR扩增反应液中，引物、Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs均为常见组分， 其含量亦为常规。
[0014] PCR扩增反应液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR扩增反应液加 入引物对获得。例如，所述试剂盒中还可以含有2XPower Taq PCR Master Mix。加入本发 明的狗粪便污染检测引物对即可获得PCR扩增反应液。
[00?5 ] 所述试剂盒中还可含有阳性对照。阳性对照含有Fae ca 1 i bac t er i um菌保守序列， 可为含有Faecal ibacterium菌保守序列的质粒。所述的阳性对照也可以为灭活的 Faecal ibacterium菌培养液。还可采用现有Faecal ibacterium菌检测试剂盒中的阳性对 照，也可单独市购或根据现有技术自行构建。
[0016] 所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为各种不含有Faecal ibacterium菌 的溶液，如PCR反应缓冲液、无菌水(DEPC-H20)、生理盐水等。
[0017] 本发明的第四方面，提供一种采用前述狗粪便污染检测试剂盒进行狗粪便污染检 测的方法，包括如下步骤： (1) 提取样品基因组DNA; (2) 加样:将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR扩增反应液的PCR 管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管； (3 )PCR扩增:反应管置于PCR仪上，设置反应参数，进行PCR扩增； (4)PCR反应结束后，采用扩增产物分析结果。
[0018] 步骤（1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。优选地，可采用MO-BIO PowerSoil ? DNA Isolation kit提取样品基因组DNA。
[0019]优选地，步骤(2)中，各反应管中，PCR扩增反应液的体积为15ul，含样品基因组DNA lul，正向引物（10uM/L)0.5ul，反向引物（10uM/L)0.5ul，2XPower Taq PCR Master Mix 7.5ul，无菌水补足至15 ul。
[0020] 优选地，步骤(3)中，PCR扩增的程序为:预变性96°C/300s ;变性96°C/30s，退火64 °C/30s，延伸 72 °C/30s，32 次循环。
[0021] 优选地，步骤(4)中，将扩增产物琼脂糖凝胶电泳进行结果分析。
[0022] 本发明的第五方面，提供了前述试剂盒在制备狗粪便污染检测产品中的用途。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 本发明的狗粪便污染检测引物对以及检测试剂盒对狗粪便污染检测特异性高达1〇〇%， 最低检测限(LOQs)为3.90拷贝数/反应，阳性率高达88%。采用所述引物对及试剂盒能够快 速判定水体是否被污染，并定位污染源。
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【附图说明】
[0025]图1A:六个物种的ED-1扩增产物5ul用2%琼脂糖凝胶电泳进行分析所的结果。
[0026] 图1B:通用引物对FUP对六个物种奠便中Faecal ibacterium菌都能扩增并产生相 应的条带。
[0027] 图2: ED-1扩增狗奠便中Faecal ibacterium菌的定量PCR标准曲线结果。
[0028]图3:50个阳性样品中有44个样品可以通过引物对ED-1进行PCR扩增并可看到明显 条带，其阳性率为88%。
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【具体实施方式】
[0030] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
[0031] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。