时间不同 的4组，挑选出设计的8组引物中特异性最好的引物组（以没有二聚体的单一条目的带为引 物筛选理由）检测结果如图1所示：
[0050]图1表示EGFR19号染色体引物的特异性。从左至右依次显示了阳性对照组（细菌 DNA，143bp目的片段）、阴性对照组(无样本DNA)、20minl9号染色体缺失阳性细胞系(HCC827 细胞系，266bp)和阴性细胞系(A549细胞系）、15minl9号染色体缺失阳性细胞系(HCC827细 胞系，266bp)和阴性细胞系(A549细胞系）、10minl9号染色体缺失阳性细胞系(HCC827细胞 系，266bp)和阴性细胞系(A549细胞系)和5minl9号染色体缺失阳性细胞系(HCC827细胞系， 266bp)和阴性细胞系(A549细胞系）。5~20min都能够特异性的扩增到目的片段，即EGFR19 号染色体引物的扩增时间至少为5min，而考虑到杂质等因素，最优的扩增时间为15min。 [0051 ] 实施例2
[0052] 本发明在筛选单个核苷酸多态性EGFRL858R的具体过程为：
[0053]在筛选目的基因片段多态性之前，先根据缺失碱基位置寻找一对合适(考虑特异 性和敏感性)的引物，即利用NCBI网站中的BLAST工具（http://blast.ncbi .nlm.nih.gov/ Blast, cgi )，检查引物的理论特异性，还利用了网站 http:// www6 · appliedbiosystems · com/support/pnadesigner · cfm.筛选了 PNA退火温度Tm值为66 °C )。利用含有此多态性的细胞系H-1975和未含有此多态性的细胞系A549进行扩增筛选并 且利用琼脂糖凝胶电泳再次筛选引物的特异性和敏感性。
[0054] 此探究过程中试剂及样本加入量及顺序:将1 OyL双蒸水、2yLPNA、2yL样本DNA (浓 度为150ng/yL)，预先进行99°C解链2min，66°CPNA-DNA结合2min，再加入2yL正向引物、2yL 反向引物（引物浓度均为1 ΟμΜ)、和29.5yL重泡胀缓冲液(rehydration buf f er)加入到含有 冻干扩增酶（TwistDX，Cambridge，UK)的EP管中，混匀后再向其中加入2.5yL醋酸镁溶液 (280mM)混匀、扩增，合适的扩增时间为15min。再加入浓度为200X的SYBR GreenI (Solarbio,北京，索莱宝科技有限公司，每20yL产物应用lyL)，以上均考虑到敏感性和特异 性的平衡。显示结果。
[0055]
[0056]
[0057]为了检测筛选EGFRL858R点多态性中设计的引物的特异性，按照上述方法，分别对 下述样品进行检测：1.以TwistDX扩增试剂盒(TwistDX，Cambridge，UK)中的阳性对照(细菌 DNA，143bp)为本实验的阳性对照组、2.以无样本DNA为阴性对照组、L858R基因多态性阳性 细胞系H1975细胞系为检测对象，未含有此点多态性的A549细胞系为阴性检测对象，两两一 组，分为扩增时间不同的4组，设计的10组引物中特异性最好的引物组（以没有二聚体的单 一目的条带为引物筛选理由）检测结果如图2所示：
[0058]图2表示筛选EGFRL858R点多态性中设计的引物的特异性。从左至右依次显示了阳 性对照组（细菌DNA，143bp目的片段）、阴性对照组(无样本DNA)、10minL858R阳性细胞系 (H1975细胞系，目的片段长201bp)和阴性细胞系（A549细胞系）、15minL858R阳性细胞系 (H1975细胞系，201bp)和阴性细胞系(A549细胞系）、20minL858R阳性细胞系(H1975细胞系， 201bp)和阴性细胞系(A549细胞系）和5minL858R阳性细胞系(H1975细胞系，201bp)和阴性 细胞系(A549细胞系）<a〇min-20min都特异性的扩增了目的片段。5min时间不适用于此筛 选。即EGFRL858R点多态性中设计的引物的扩增时间至少为lOmin，而考虑到杂质等因素，最 优的扩增时间为15min。
[0059] 实施例3
[0060]筛选本发明(ARPS)的敏感度的具体实施过程为：
[00611 1.将含有多态性的细胞系DNA和非多态性细胞系DNA混合，分别将多态性细胞系 DNA(总 DNA 含量为 300ng)分别稀释为浓度为 100%、80%、60%、40%、30%、20%、10%和 0%。（ 100 %即300ng的DNA全部为多态性细胞系DNA，80%即300ng的DNA中有240ng为多态性 细胞系DNA，60ng为非多态性细胞系DNA，以此类推）
[0062] 2 .按照实施例1所述方法，分别对下述样品进行检测：除了试剂盒中的阳性对照 (+ )和无 DNA的阴性对照（-)，还将多态性细胞系DNA(HCC-827)和正常目的基因片段细胞系 DNA(A-549细胞系）混合，多态性细胞系DNA(HCC-827)分别占 100%、80%、60%、40%、30%、 20 %、10%和0%。图示3A显示HCC-827细胞系DNA占 100%、80%、60%、40%和30% 时，均可 产生肉眼可见的绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳结果也证实了这一点（单一目的条带的产生）。 结果说明检测19号染色体缺失多态性的灵敏度为30% ;
[0063] 按照实施例2所述方法，分别对下述样品进行检测：除了试剂盒中的阳性对照(+ ) 和无 DNA的阴性对照（-)，还将多态性细胞系DNA(H-1975)和正常目的基因片段细胞系DNA (A-549)混合，多态性细胞系 DNA(H-1975)分别占 100%、80%、60%、40%、30%、20%、10% 和0%。图示3B显示H-1975细胞系DNA占100%、80%、60%、和40%时，均可产生肉眼可见的 绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳结果也证实了这一点（单条带产生）。结果说明检测L858R多态性 的灵敏度为40 %;
[0064] 分别反应后发现在EGFR19Del多态性中的敏感度为30%(多态性DNA含量，如图 3A)，即，在EGFR19Del多态性中的敏感度为待检样本中目的DNA片段的量至少为gOngiGFR L858R多态性中的敏感度为40%(多态性DNA含量，如图3B)。即，在EGFR L858R多态性中的敏 感度为待检样本中目的DNA片段的量至少为120ng。
[0065] 实施例4
[0066] 筛选的冰冻组织样本中EGFR19Del (2)型多态性的情况
[0067]本发明收集的手术切除样本来自大连医科大学附属第二医院(大连，中国）在2015 年接受病理治疗的患者(均根据对肺癌的分期方案确诊的46例肺癌患者）。该研究通过了大 连医科大学附属第二医院审核，每个参与这项研究的病人均签署过了书面知情同意书。这 一组患者包括25名女性和21例男性，从42至87岁（中位数66岁）。手术切除后，所有的切除组 织立刻快速冷冻并储存在_80°C直至使用。
[0068]为了进一步评估EGFR突变多态性的非小细胞肺癌组织标本，本发明收集的46例非 小细胞肺癌患者手术切除组织样本，在我院采用突变多态性特异性扩增系统(ARMS)筛选出 三例为表皮生长因子受体L858R多态性和一例EGFR19号染色体缺失的基因多态性样本，本 发明利用测序法再次确认了这四个突变多态性样本和两个非突变多态性标本中的目标靶 DNA序列，然后利用本发明进行筛查(图4)。
[0069]本发明利用细胞系HCC-827和A549分别作为阳性和阴性对照（质控），白色背景为 筛选环境，筛选临床冰冻标本的基因多态性情况。然后，本发明使用ARPS新方法筛选了这六 个组织样品中EGFR相关序列多态性(如实施例1)，并发现15min扩增后，混合预先滴加在EP 管帽上的SYBR即出现可视化的结果（图4A)，并与DNA测序结果一致。
[0070]具体步骤为：将上述实施例1中验证成功的HCC-827细胞系DNA作为阳性对照，A-549细胞系DNA做为阴性对照，新鲜冰冻样本I、5、6(casel、case5、case6)为筛查对象，将12μ L双蒸水、2yL正向引物、2yL反向引物（引物浓度均为1 ΟμΜ)、2yL样本DNA(浓度为150ng/yL) 和29.5yL重泡胀缓冲液（rehydration buf fer)加入到含有冻干扩增酶（Twi stDX， Cambridge，UK)的EP管中，混匀后再向其中加入2.5yL醋酸镁溶液（280mM)混匀、扩增。扩增 15min后，将预先滴在EP管盖内的2.5yL的SYBR混匀(每20yL产物加入lyLSYBR)，观察结果。 [0071] ARPS结果显示新鲜冰冻样本l(casel)产生肉眼可见的绿色荧光，并与PCR扩增后 测序法结果相一致(多态性阳性）；样本5和6没有产生肉眼可见的绿色荧光;新鲜冰冻样本 经PCR扩增后测序结果也为多态性阴性。
[0072] 筛选的临床样本中EGFR L858R多态性的情况
[0073]本发明利用细胞系H-1975和A549分别作为阳性和阴性对照（质控），白色背景为筛 选环境，筛选临床冰冻标本的基因多态性情况。本发明（ARPS)筛选了这六个组织样品中 EGFR相关序列多态性，并发现15min扩增后，混合预先滴加在EP管帽上的SYBR即出现可视化 的结果（图4B)，并与DNA测序结果一致。
[0074]具体步骤为:将上述实施例2中验证成功的H-1975细胞系DNA作为阳性对照，A-549 细胞系〇嫩做为阴性对照，新鲜冰冻样本2、3、4、5、6(〇3862、〇380 3、〇3864、〇3865、〇3866)为 筛查对象，将10yL双蒸水、2yLPNA、2yL样本DNA(浓度为150ngAiL)，预先