增阴性样本。
[0030] 由于RPA扩增速度非常迅速，传统PNA利用方法(PNA直接加入到反应体系中，以抑 制非特异性片段扩增)很难在RPA扩增中实现(如本发明实施例5所述方法的图5结果显示： 即便加入PNA，但是如果没有预先使PNA与非靶序列结合，即预先使PNA与样本99°C解链 2min，66°C结合2min，（即便再加上另外的错配碱基），其结果还是阳性和阴性多态性细胞系 均显示绿色荧光，电泳结果也显示假阳性，（即都有单条带产生），本发明利用PNA-DNA结合 温度高于DNA-DNA结合温度的特点（在此实验中，相同长度寡核酸引物DNA与模板DNA结合温 度低于相同长度寡PNA与模板DNA结合温度约10°C左右），将PNA成功用于检测筛选单个核苷 酸多态性的方法中。
[0031] 本发明(ARPS)总结出一套标准化流程和阴阳质控（以细胞株DNA为质控品）的筛选 人类基因多态性的方法:浓度为20μΜ的PNA溶解液2yL，300ng样本DNA，浓度为10μΜ的引物溶 解液各2yL，扩增时间为15min，再加入浓度为200X的SYBR GreenI(Solarbio，北京，索莱宝 科技有限公司，每20yL产物应用UiL)，以上考虑到敏感性和特异性的平衡。由于扩增体系已 经确立，即只需要加入已知浓度的样本DNA即可在15min内筛选出其有无相应的基因多态 性。筛选不同的目的靶基因只需要调整相应引物和PNA。
【附图说明】
[0032]图1表示筛选的具有很好的特异性的EGFR19号染色体的引物。从左至右依次显示 了阳性对照组(细菌DNA，143bp目的片段）、阴性对照组(无样本DNA)、扩增时间为20min的19 号染色体缺失阳性细胞系（HCC827细胞系，目的片段266bp)的DNA样本个和阴性细胞系 (A549细胞系）DNA样本、15min的19号染色体缺失阳性细胞系（HCC827细胞系，266bp)DNA和 阴性细胞系(A549细胞系)DNA、10min的19号染色体缺失阳性细胞系(HCC827细胞系，266bp) DNA和阴性细胞系(A549细胞系)DNA和5min的19号染色体缺失阳性细胞系(HCC827细胞系， 266bp)DNA和阴性细胞系(A549细胞系^NAiP管上面标记了结果的颜色，各个时间段都产 出了特异性的目的片段。
[0033]图2表示筛选EGFRL858R多态性中设计的引物的特异性。从左至右依次显示了阳性 对照组(细菌DNA，143bp目的片段）、阴性对照组(无样本DNA)、扩增时间为lOmin的L858R阳 性细胞系（H1975细胞系，目的片段201bp)DNA和阴性细胞系（A549细胞系）DNA、15min的 L858R阳性细胞系（H1975细胞系，201bp)DNA和阴性细胞系(A549细胞系）DNA、20min的L858R 阳性细胞系（H1975细胞系，201bp)DNA和阴性细胞系(A549细胞系）DNA和5min的L858R阳性 细胞系(H1975细胞系，201bp)DNA和阴性细胞系(A549细胞系^NAiP管上面标记了结果的 颜色，10min-20min都特异性的扩增了目的片段。5min时间不适用于此筛选。
[0034] 图3显示ARPS筛选的灵敏度：
[0035] A:筛选19号染色体缺失（2)的特定引物与经过稀释的HCC-827细胞系的基因组DNA 反应。HCC-827细胞系DNA的稀释液，30%以上的阳性细胞系(HCC-827细胞系）
[0036] DNA用ARPS或电泳均可检测出结果（肉眼可见的绿色荧光和单一目的条带）；
[0037] B:筛选L858R点多态性特异性引物与经过稀释的H-1975细胞系的基因组DNA反应。 H-1975细胞系DNA的稀释液，40%以上的阳性细胞系(!1-1975细胞系)0嫩用八1^或电泳均可 检测出结果（肉眼可见的绿色荧光和单一目的条带）。
[0038]图4筛选冰冻组织样本中的基因多态性：
[0039] A:显示筛选的冰冻组织样本中EGFR19Del(2)型基因多态性的情况。从上至下依次 阳性质控(HCC827细胞系DNA，经实施例1确定为有此基因多态性的DNA)、阴性质控(A549细 胞系DNA，经验证无此基因多态性的DNA)、一个经过直接测序法筛选验证过的冰冻组织多态 性样本、两个经过直接测序筛选过的冰冻组织非多态性样本。（左边为本发明筛选结果，右 边为直接测序验证结果）左边结果(本发明肉眼可见检测结果)从上至下依次为多态性阳性 (质控，绿色）、多态性阴性（质控，黄色）、多态性阳性（样本，绿色）、多态性阴性（样本，黄 色）、多态性阴性(样本，黄色）；右边(直接测序)结果从上至下依次为阳性对照；阴性对照； 样本1测序结果：TCGCTATCAAG (此处缺失15个碱基）ACATCTCCG;样本5测序结果： TCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCG;样本 6 测序结果:TCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCG。（划 线字母为未缺失的15个喊基序列）。
[0040]图4B:显示筛选的冰冻组织样本中EGFRL858R基因多态性的情况。从上至下依次为 阳性质控(H1975细胞系DNA经实施例2确定为有此基因多态性的DNA)、阴性质控(A549细胞 系DNA，经验证无此基因多态性的DNA)和三个先经过直接测序法筛选验证的冰冻组织样本。 (左边为本发明筛选结果，右边为直接测序验证结果)左边结果(本发明肉眼可见的检测结 果)从上至下依次为多态性阳性(质控，绿色）、多态性阴性(质控，黄色）、多态性阳性(样本， 绿色）、多态性阳性(样本，绿色）、多态性阳性(样本，绿色）、多态性阴性(样本，黄色）、多态 性阴性(样本，黄色）；直接测序结果从上至下依次为阳性对照；阴性对照;样本2测序结果： TGGCC^GCCCA;样本3测序结果:TGCC^GCCCA;样本4测序结果:TGGCC^GCCCA;样本5测序结果： TGGCCAGCCCA;样本6测序结果:TGGCCAGCCCA(划线字母为多态性的碱基序列，此为杂合多态 性)。
[0041 ]图5.筛选EGFRL858R引物时无预先使PNA与样本DNA结合情况下，显示的引物序列、 ARPS结果和琼脂糖凝胶电泳数据。A:以筛选EGFR L858R的另一个错配碱基在反向引物中的 位置（淡色字母并且下有黑框标记）』，琼脂糖凝胶电泳和ARPS的结果。目的片段长度为 20lbp的"+"表示从RPA反应试剂盒（143bp)的阳性对照。所使用的DNA量为300ng。图中显示 无论再多加任何的错配碱基T、A、G，都会产生假阳性结果，即阳性细胞系和阴性细胞系均为 绿色，而阴性质控品(无 DNA)为黄色，则结果可靠。 图1: EGFR19号染色体引物的特异性。 图2:筛选EGFRL858R点多态性中设计的引物的特异性。 图3A: 19号染色体缺失多态性的灵敏度 图3B:检测L858R多态性的灵敏度 图4A:显示检测筛选的临床样本中EGFR19Del(2)型多态性的情况。 图4B:显示筛选的临床样本中EGFRL858R多态性的情况。 图5:显示引物序列和琼脂糖凝胶电泳数据。A:筛选EGFR L858R的另一个错配碱基在反 向引物中的位置(绿色字母）』:琼脂糖凝胶电泳和ARPS的结果。
【具体实施方式】
[0042]下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于具体实施 例。
[0043] 人类非小细胞肺癌细胞株NCI-H1975，HCC-827和A-549得自美国模式菌种收集中 心(ATCC，Manassas，VA，USA)获得，并保持在RPMI-1640培养基(Gibco，美国），并用10%胎牛 血清(HyClone公司，美国），100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，在37°C在含有5% C02和95% 空气的潮湿培养箱中。其NCI-H1975细胞含有所述EGFR21号外显子L858R的单个核苷酸多态 性，HCC-827细胞含有所述EGFR19号外显子15个碱基的缺失，和A-549细胞含有野生型EGFR 目标DNA序列。
[0044] 实施例1
[0045] 筛选15个碱基缺失的EGFR19De 1 (2)多态性的具体过程为：
[0046]在筛选目的基因片段多态性之前，先根据缺失碱基位置寻找一对合适(考虑特异 性和敏感性)的引物，即利用NCBI网站中的BLAST工具（http://blast.ncbi .nlm.nih.gov/ Blast, cgi)，检查引物的理论特异性。利用含有此多态性的细胞系HCC827和未含有此多态 性的细胞系A549进行扩增筛选并且利用琼脂糖凝胶电泳再次确定筛选引物的特异性和敏 感性。
[0047] 此探究过程中试剂及样本加入量及顺序:将12yL双蒸水、2yL正向引物、2yL反向引 物（引物浓度均为1〇μΜ)、2μL样本DNA(浓度为150ng/yL)和29.5yL重泡胀缓冲液 (rehydration buffer)加入到含有冻干扩增酶(TwistDX,Cambridge，UK)的EP管中，混勾后 再向其中加入2.5yL醋酸镁溶液(280mM)混匀、扩增。最合适的扩增时间为15min，再加入浓 度为200X的SYBR GreenI (Solarbio，北京，索莱宝科技有限公司），每20yL产物应用lyL。以 上均考虑到敏感性和特异性的平衡。
[0048]
[0049]为了检测筛选EGFR19Del(2)多态性中设计的引物的特异性，按照上述方法，分别 对下述样品进行检测：1.以TwistDX扩增试剂盒(TwistDX，Cambridge，UK)中的自带阳性细 菌DNA片段，扩增后电泳条带长度为143bp为本实验阳性对照组、2.以无样本DNA为阴性对 照组、19号染色体缺失阳性细胞系HCC827和阴性细胞系A549两两一组，分为扩增