)，纵坐标代表浊度。左1为10 8 ;左2为10 9左3为10 ; 左4为10 11 ;左5为10 12 ;左6为10 13 ;左7为10 14 ;左8为10 15 ;右1为10 16 ;右2为10 17 ; 右3阴性对照。
[0035] 图5为发明实施例6中LAMP通用引物反应恒温水浴实验的可视化结果。1为系统 阳性照；2为黄曲霉；3为奇生曲霉；4为溜曲霉；5为烟曲霉；6为杂色曲霉；7为阴性对照。
【具体实施方式】
[0036] 实施例1用于检测曲霉属产毒真菌LAMP通用引物的设计与合成
[0037] 选取5种曲霉属产毒真菌所共有的ATP柠檬酸裂解酶基因，根据NCBI比对结果， 选取共有序列区域设计引物。使用LAMP法引物设计支持软件PrimerExplorer设计引物， 在线设计网址为：http ://primerexplorer. jp/e/。通过筛选选取一套符合LAMP引物设计 要求的引物。所述引物包括2条外侧引物（F3、B3)，2条内侧引物（FIP、BIP)和2条环引物 (LF和LB)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。ATP柠檬酸裂解酶基因可作为鉴 定曲霉属产毒真菌的通用基因。
[0038] 实施例2曲霉属产毒真菌基因组DNA模板的制备
[0039] 使用改良的CTAB法提取基因组DNA。黄曲霉菌（40536)、寄生曲霉菌（40365)、 溜曲霉菌（30585)、烟曲霉菌（3. 5835)和杂色曲霉菌（2474)标准菌株由辽宁出入境检验 检疫局提供。详细步骤为：（1)取一定量菌丝体于研钵中，液氮研磨成粉末状后迅速转移 至lj 1. 5mL 离心管中；（2)加入 600 μ L 预热的 CTAB 溶液（2 % CTAB，200mmol/L Tris-HCl， 20mmol/LEDTA pH = 8.0，1.4mmol/L NaCl，l%PVP-40,0.2% β-巯基乙醇），迅速盖紧管 盖，充分震荡，65°C水浴30min，期间不断震荡；（3)室温冷却后加入等体积的酚-氯仿-异 戊醇（25 : 24 : 1)，反复颠倒混匀lmin，13000r/min离心10min;(4)吸取上清于另一离心 管中，加入等体积的氯仿-异戊醇（24 : 1)，反复颠倒混匀lmin，13000r/min离心10min; (5)吸取上清于另一离心管中，加入SyLlOmg/L的RNaseA溶液，37°C水浴lh ;(6)重复步骤 (3)、（4) ; (7)吸取上清于另一离心管中，加入0. 7倍体积的异丙醇和1/5倍体积的5mol/L 的NaCl溶液，颠倒混匀，4°C沉淀后4°C、13000r/min离心10min ; (8)去上清，加500 μ L70 % 乙醇清洗沉淀，4°C、13000r/min离心10min，去上清后倒扣于滤纸上，吸收管口和管壁残留 的溶液，放置干燥DNA，干燥时间为15min左右；（9)加入50 μ LTE缓冲液溶解基因组DNA， 于-20°C冰箱保存。
[0040] 实施例3利用LAMP通用引物检测曲霉属产毒真菌
[0041] 将黄曲霉、寄生曲霉、溜曲霉、烟曲霉和杂色曲霉作为样本，按照LAMP反应体系进 行扩增，验证LAMP通用引物检测曲霉属产毒真菌的时间和温度。分析LA-320C程序的出峰 时间，如图1所示。从图1可以看出，LAMP通用引物在10-llmin之间内5种真菌全部开始 发生扩增反应，反应温度适宜。
[0042] 实施例4利用LAMP通用引物检测曲霉属产毒真菌的特异性分析
[0043] 将属间的禾谷镰刀菌、茄镰孢菌、岛青霉菌、鲜绿青霉菌以及金黄色葡萄球菌和大 肠杆菌等作为样本，进行特异性检验，按照LAMP反应体系进行扩增，以黄曲霉为阳性对照， 验证曲霉属产毒真菌通用引物组合的特异性。分析LA-320C程序的出峰时间及峰值，如图2 和图3所示。从图2和图3可以看出，引物只与黄曲霉呈阳性反应，与属间禾谷镰刀菌，茄 镰孢菌、岛青霉菌以及金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均无扩增反应发生，证明曲霉属产毒真 菌通用引物组合有较好的特异性。
[0044] 实施例5利用LAMP通用引物检测曲霉属产毒真菌的灵敏度分析
[0045] 以黄曲霉为模板，将黄曲霉模板DNA按10n比例分别稀释到10 8、10 9、10 '10 n、 10 12、10 13、10 14、10 15、10 16、10 17倍的十个梯度，单位为g/ μ L。分别取各稀释度的2 μ L进 行LAMP实验，验证LAMP法的灵敏度，确定LAMP法检测曲霉属产毒真菌的最低检测浓度。 分析LA-320C程序的峰值，如图4所示。从图4可以看出，黄曲霉基因组DNA模板稀释到 1 X 10 12g/ μ L后也可检测到扩增反应发生，灵敏度达到皮克级别。
[0046] 实施例6利用LAMP引物检测曲霉属产毒真菌的恒温水浴实验
[0047] 对曲霉属产毒真菌的检测进行恒温水浴实验，按照反应体系加入本发明的LAMP 引物，进行恒温水浴实验。反应条件为水浴恒温63°C，反应60min。通过观察浑浊度判断是 否有扩增发生。如图5所示。通过恒温水浴实验发现，在63°C恒温水浴的情况下，经过一定 的反应时间，5种曲霉属产毒真菌反应管中均出现混浊现象，说明本发明中曲霉属产毒真菌 的LAMP通用引物组可在恒温水浴的条件下发生扩增反应。恒温水浴实验证明了 LAMP反应 不需要特殊的仪器而且操作方便的特点。检测结果直接用肉眼就可以观察，不需要大型的 仪器进行实验结果检验。
[0048] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的 限定。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变 化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变 化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种检测曲霉属产毒真菌的LAMP通用引物，其特征在于，其中包括：外侧正向引物F3: 外侧反向引物B3 : 内侧正向引物FIP 内侧反向引物BIPW及环引物LF 环引物LB ;5' -2. -种包含权利要求1中所述LAMP通用引物的检测曲霉属产毒真菌的试剂盒，包括 LAMP通用引物、Bst DNA聚合酶、含dNTPs的反应缓冲液和去离子水，其特征在于，其中包括 的LAMP通用引物为权利要求1中所述LAMP通用引物。3. 根据权利要求2所述的检测曲霉属产毒真菌的试剂盒，其特征在于，所述的含dNTPs 的反应缓冲液包含 dNTPs2. 8mmol/L、40mmol/L P册.8 的化13-肥1、20臟〇1/1 KCl、20mmol/ 1^(畑4)25〇4、16111111〇1/11拆〇4、0.2%吐温20^及1.6111〇1/1甜菜碱。4. 根据权利要求2所述的检测曲霉属产毒真菌的试剂盒，其特征在于，所述的LAMP 通用引物包括 40pmol/U L 引物 FIP50 U L、40pmol/U L 引物 BIP50 U L、5pmol/U L 引物 F3 50y L、5pmol/y L 引物 B3 50y L、20pmol/y L 引物 LFSOy L、20pmol/y L 引物 LBSOy L。5. 根据权利要求2所述的检测曲霉属产毒真菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中 Bst DNA聚合酶浓度为8U/ U L，含量为50 U L ;含dNTPs的反应缓冲液含量为ImU去离子水 含量为ImL。6. -种利用权利要求2中所述的试剂盒检测曲霉属产毒真菌的方法，其特征在于，包 括W下步骤： (1)提取模板DNA ; 似W步骤（1)中提取的DNA为模板，采用权利要求2中所述的检测曲霉属产毒真菌的 试剂盒进行LAMP扩增反应； (3) LAMP扩增结果判定。7. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤（2)中的LAMP扩增反应体系为 25 各组分含量如下： 模板DNA 2咕 40pmol心L 引物 FIP I^iL 40 pmol/曲引物 BIP IpL 5 pmol/|xL 引物 F3 1[jL 5pmol4iL 引物 B3 I山L 20 pmol/阵引物 LB 1 |xL 20pmol/咕引物 LF InL 含dNTP的反应缓冲液 12.5|xL 化f DNA聚合酶 l^lL 加 H20 3.5^lL。8. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤（2)所述LAMP扩增反应的温度 为63°C，时间为60min〇9. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤（3)利用LA-320C浊度仪进行 LAMP扩增反应，通过程序显示的浑浊度鉴定所述步骤（2)中特异性扩增产物的存在。
【专利摘要】本发明涉及一种检测曲霉属产毒真菌的LAMP通用引物及包含该引物的试剂盒。本发明所述的LAMP引物包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，以及环引物LF和LB；所述试剂盒包括所述LAMP引物、Bst？DNA聚合酶、含dNTPs的反应缓冲液和去离子水。本发明将环介导等温扩增技术用于曲霉属产毒真菌的快速检测，可以快速、准确、方便地检测出曲霉属产毒真菌，对曲霉属产毒真菌污染的预防和检测具有重要意义。本发明所述的检测方法特异性强，灵敏度较高，检测下限可达到1×10-12g/μL，反应时间短，可操作性强，不需要昂贵的仪器来实现；并且产物检测方便，通过肉眼观察法就能实现，具有很高的实用价值。
【IPC分类】C12Q1/04, C12Q1/68, C12N15/11, C12R1/66
【公开号】CN105648038
【申请号】
【发明人】黄耀江, 蒋丹, 靳卫林, 孙雷, 闫强
【申请人】黄耀江, 中央民族大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年8月21日