一种检测曲霉属产毒真菌的lamp通用引物及包含该引物的试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测曲霉属产毒真菌的LAMP通用引物以及包含该引物的试剂 盒，同时涉及一种使用包含该引物的试剂盒快速检测曲霉属产毒真菌的方法。属于食品安 全检测和微生物检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 曲霉属产毒真菌是常见腐生真菌，多见于发霉的粮食、粮制品及其它霉腐的 有机物上，菌落生长较快，结构疏松，菌体由许多复杂的分枝菌丝构成。曲霉属是丛 梗孢目、丛梗孢科中的一个属，产真菌毒素的菌种主要有：黄曲霉（A. flavus)、寄生 曲霉（A. parasiticus)、杂色曲霉（A. versicolor)、烟曲霉（A. fumigatus)、赫曲霉 (Aspergillus ochraceus)、溜曲霉（Aspergillus tamari)、灰绿曲霉（A. glaucus)、构巢曲 霉（A. nidurans)等。这些曲霉菌的有毒次级代谢产物为黄曲霉毒素、杂色曲霉素、烟曲霉 震颤素、赭曲霉毒素等
[0003] 曲霉属产毒真菌及真菌毒素广泛地污染农作物、食品及饲料等植物源性产品。有 些真菌能够直接引起人和动物的疾病，真菌毒素不但会影响人和动物的健康，而且还会造 成十分严重的经济损失。因此急需研究简便、经济和可靠的快速检测技术。本发明主要研 究曲霉属产毒真菌的快速检测方法，主要检测菌种包括黄曲霉、寄生曲霉、杂色曲霉、烟曲 霉和溜曲霉。
[0004] 目前我国对产毒真菌的检测都是根据菌体形态和显微镜下特征进行分类与鉴定， 但是该方法鉴定周期长、时效性差，需要有经验的专家或实验人员才能准确分辨，且容易出 现假阳性或假阴性结果，已经远远不能满足高速发展的食品和饲料进出口检测需求。近些 年来，国内和国外已经开始运用生物化学和分子生物学等方法开始对产毒真菌进行检测。 PCR基础上发展而来的环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，是由日本荣研株式会社的Notomi等人于2000年开发出来的一种新型核酸扩增方 法。它依赖于4条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、 快速、高特异地扩增靶序列。这种链置换型的DNA聚合酶，使模板两端的引物结合处循环出 现环状单链结构，保证引物顺利的与模板结合，进行链置换扩增反应。该技术更克服了需要 反复热变性的PCR反应的特点，有效避免了升降温的过程当中耗时的缺点，实现了恒温条 件下的连续快速扩增，可以在15_60min之内扩增10 9-101(]倍靶序列拷贝。扩增产物检测快 速简单，方法多样，主要有肉眼观察沉淀法、荧光染料检测法、琼脂糖凝胶电泳法和浊度仪 检测法。LAMP具有扩增效率高，灵敏度强，特异性好的优点，而且不需要昂贵的PCR仪和试 剂，只需要一个恒温加热装置即可，成本低，适用于在基层使用，在普通的实验室具有很好 的应用前景，适用于曲霉属产毒真菌的检测。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种检测曲霉属产毒真菌的LAMP通用引物，和一种包含该引物的 试剂盒，以及一种使用该试剂盒检测曲霉属产毒真菌的LAMP方法，可以快速、特异、简便、 廉价的检测曲霉属产毒真菌，从而弥补现有技术在相关检测方面速度慢、成本高等不足，对 农作物、食品、某些药品及饲料安全检测具有重要作用。
[0006] 为解决以上技术问题，本发明是通过下述技术方案来实现的：
[0007] -种检测曲霉属产毒真菌的LAMP通用引物，其特征在于，其中包括：
[0008] 外侧正向引物 F3 :5' -TTGGTGGTGGTATTGCCAA-3' ；
[0009] 外侧反向引物 B3 :5' -GACGTGCATGTTGAGGCC-3' ；及
[0010] 内侧正向引物 FIP :5 ' -CAGAACAGGGGCGACCTCAC-CTTCACCAACGTTGCTTCGA-3 ' ；
[0011] 内侧反向引物 BIP :5' -AGCACAAGGTCCAGATCTGGGT-TCCTCACCAACGGACTTGA-3' ；
[0012] 以及环引物 LF :5' -GCACGGATGACACCCTTG-3' ；
[0013] 环引物 LB :5，-CCGTCGTGCTGGTCCTA-3，。
[0014] -种包含上述LAMP通用引物的检测曲霉属产毒真菌的试剂盒，包括LAMP引物、 BstDNA聚合酶、含dNTPs的反应缓冲液和去离子水，其特征在于，其中包括的LAMP通用引物 为上述的LAMP通用引物。
[0015] 上述的检测曲霉属产毒真菌的试剂盒，其特征在于，所述的含dNTPs的反应缓冲 液包含（1犯1^2.8111111〇1/1、40111111〇1/1?!18.8的1^8-!1(：1、20111111〇1/11((：1、20111111〇1/1(順 4)2504、 16臟〇1八]\%304、0.2%吐温20以及1.61]1〇1八甜菜喊。
[0016] 上述的检测曲霉属产毒真菌的试剂盒，其特征在于，所述的LAMP通用引物包括 40pmol/y L 引物 FIP50y L、40pmol/y L 引物 ΒΙΡ50μ L、5pmol/y L 引物 F3 50μ L、5pmol/ μ L 引物 B3 50 μ L、20pmol/ μ L 引物 LF50 μ L、20pmol/ μ L 引物 LB50 μ L。
[0017] 上述的检测曲霉属产毒真菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中Bst DNA聚合酶 的浓度为8U/μ L，含量为50 μ L，含dNTPs的反应缓冲液含量为lmL，去离子水含量为lmL。
[0018] -种利用上述的试剂盒检测曲霉属产毒真菌的方法，其特征在于，包括以下步 骤：
[0019] (1)提取模板 DNA;
[0020] (2)以步骤⑴中提取的DNA为模板，采用上述的检测曲霉属产毒真菌的试剂盒进 行LAMP扩增反应；
[0021] (3) LAMP扩增结果判定。
[0022] 上述的检测方法，其特征在于，步骤（2)中的LAMP扩增反应体系为25 μ L，各组分 含量如下：
[0023] 模板DNA 2pL 40pmol/VL 引物 ΠΡ lpL 40 pmol/pL 引物 BIP l(xL 5 pmol^iL 引物 F3 ΙμL 5 pmol/pL 引物 B3 ΙμL 20pmol/pL 引物 LB 1成 20 pmol/pL 引物 LF 1 μL 含dNTP的反应缓冲液 12.5|iL DNA聚合酶 l|〇L dd Η20 3.5μL。
[0024] 上述的检测方法，其特征在于，步骤（2)所述LAMP扩增反应的温度为63°C，时间为 60min〇
[0025] 上述的检测方法，其特征在于，步骤（3)利用LA-320C浊度仪进行LAMP扩增反应， 通过程序显示的浑浊度鉴定所述步骤（2)中特异性扩增产物的存在。
[0026] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0027] 1.本发明所述的检测曲霉属产毒真菌的LAMP通用引物及包含该引物的试剂盒， 在检测曲霉属产毒真菌时快速和高效：核酸扩增在lh内即可完成，并且可检测出多种类的 曲霉属产毒真菌。有发明专利（授权公告号CN101381771B)涉及一种产黄曲霉毒素真菌环 介导等温扩增快速检测方法，该方法仅是针对产黄曲霉毒素的真菌的检测，而本发明的优 点是可以检测出曲霉菌属中能够产生真菌毒素的真菌，非针对于个别真菌毒素基因序列的 检测。因此本发明可检测出曲霉属产毒真菌的污染，对曲霉属产毒真菌污染的预防和检测 具有重要意义。
[0028] 2.本发明所述的一种检测曲霉属产毒真菌的LAMP通用引物及包含该引物的试剂 盒，所述LAMP通用引物以曲霉属产毒真菌共有的ATP柠檬酸裂解酶基因为靶基因进行扩 增；该基因序列在曲霉属产毒真菌中具有高度的同源性，相对于其他真菌具有高度特异性， 因而可以实现曲霉属产毒真菌的特异性检测。
[0029] 3.本发明所述的LAMP法检测曲霉属产毒真菌，针对靶序列的6个区域设计了 4种 特异性引物，6个区域中任何一处与引物不匹配均不能进行核酸扩增，且与其它种属的真菌 不发生扩增反应，因而具有高特异性；同时本方法具有高灵敏度，所需模板拷贝量少，检测 下限约为lxl〇 12g/yL。
[0030] 4.本发明所述的LAMP反应可操作性强，避免使用昂贵的热循环仪，只要求简单的 恒温的反应仪器，必要时只准备恒温的水浴加热即可完成此操作；并且产物检测方便，通过 肉眼观察浑浊度就能实现；所述包含该引物的试剂盒中所用的检测试剂均为市售常见化工 试剂，检测便利。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明实施例3中LAMP通用引物组检测曲霉属产毒真菌扩增曲线图。横 坐标代表反应时间（min)，纵坐标代表浊度。图中曲线为本发明中的5种曲霉属产毒真菌。
[0032] 图2为本发明实施例4中LAMP通用引物反应特异性分析的实时浊度检测扩增柱 状图，横坐标代表反应时间（min)，纵坐标代表浊度。1为黄曲霉；2为禾谷镰刀菌；3为茄镰 孢菌；4为岛青霉菌；5为鲜绿青霉菌；6为金黄色葡萄球菌；7为大肠杆菌；8为阴性对照
[0033] 图3为本发明实施例4中LAMP通用引物反应特异性分析的实时浊度检测扩增曲 线图，横坐标代表反应时间（min)，纵坐标代表浊度。图中曲线为黄曲霉扩增曲线，其它菌种 未发生扩增反应。
[0034] 图4为本发明实施例5中LAMP通用引物反应灵敏度分析的实时浊度检测扩增柱 状图。横坐标代表反应时间（min