黄蒽醌类。中草药有效成分的含量可以按照现有文献所提供的方法进行测定。黄芪多糖含量的测定方法参照:山东产黄芪中黄芪多糖和黄芪甲苷的含量测定，山东中医药大学学报，2008年5月第32卷第3期;绿原酸含量的测定方法参照:高效液相色谱法测定杜仲中绿原酸的含量，Chinese Journal of Informat1n on TCM, 2006，13(I);小檗喊含量的测定方法参照:萸连巴布膏中盐酸巴马汀和小檗碱的药动学研究，中国实验方剂学杂志，2011年3月第17卷第5期;大黄蒽醌提取物含量的测定方法参照:保肝灵颗粒剂中4种大黄蒽醌类成分的大鼠药动学研究。中成药。2013年6月，第35卷，第6期。
[0027](5)中草药配伍的筛选
实验设置为3个组，每组设3个重复。分别为:对照组添加超纯水，试验I组每毫升培养基中添加黄芪多糖8mg、绿原酸3mg、大黄蒽醌提取物7mg，试验2组每毫升培养基中添加黄芪多糖I Img、绿原酸5mg、小檗碱15mg。各试验组于C02培养箱中25 °C密闭培养。培养过程中在第6h、12h、24h进行取样，为后续的指标测定作准备。
[0028](6)指标测定
血细胞存活率的测定方法按照现有文献的方法操作，参照:H P C viabilitymeasurement: trypan blue versus acridine orange and propidium 1dide.Transfus1n 40 (6)，693-696。吞噬活性的测定方法按照现有文献的方法操作，可以参照:Immune responses and express1n of immune-related genes in swimming crabPortunus trituberculatus exposed to elevated ambient ammonia—N stress.Comparative B1chemistry and Phys1logy Part八。抗菌活力、溶菌活力的测定方法按照现有文献的方法操作，可以参照:Insect immunity.Purificat1n and properties ofthree inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae ofHyalophora cecropia.European Journal of B1chemistry。
[0029]结果分析:
(I)血细胞存活率
由图1可见:血细胞培养基加入复方中草药有效成分孵育24h后，各试验组血细胞存活率与对照组无显著差异，且存活率都大于85%以上。孵育24h内，各试验组血细胞存活率无明显变化。
[0030](2)血细胞吞噬活性
由图2可见:血细胞培养基加入复方中草药有效成分孵育24h后，试验组血细胞吞噬活性均显著高于对照组(P〈0.05)，而每次测定对照组无显著差异。两试验组中血细胞吞噬活性逐渐增高，于24h达到最高值，且试验2组中血细胞吞噬活性显著高于试验I组(P〈0.05)。
[0031](3)抗菌活性
由图3可见:血细胞培养基加入复方中草药有效成分孵育24h后，试验组抗菌活性均显著高于对照组(P〈0.05)，而每次测定对照组无显著差异。各试验组中抗菌活性于12h达到最高值，并保持稳定至24h ο试验2组中抗菌活性显著高于试验I组(P〈0.05 )。
[0032](4)溶菌活性
由图4可见:血细胞培养基加入复方中草药有效成分孵育24h后，试验组溶菌活性均显著高于对照组(P〈0.05)，而每次测定对照组无显著差异。各试验组中溶菌活性于12h达到最高值，且试验2组中溶菌活性显著高于试验I组(P〈0.05)。
[0033]由实验结果可知，试验2组的免疫增强作用高于试验I组，即在24h内，就可以通过免疫相关指标测定，对中草药提取物组合是否能够增强免疫效力有非常明确和直观的判断。说明本方法建立的复方中草药免疫增强剂筛选方法，在24h内能准确筛选出具有较强免疫增强作用的中草药组合，是一种快速、高效、稳定的筛选技术。
【主权项】
1.一种对虾用复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法，其特征在于，该方法包括首先制备对虾肌肉提取液和血细胞培养基，然后分离对虾血细胞并进行原代培养，同时提取中草药活性成分，再将中草药活性成分添加到对虾血细胞培养基中进一步培养，最后测定免疫相关指标。2.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述对虾肌肉提取液的制备方法为:幼虾经暂养后，取腹部肌肉加入平衡盐进行匀浆，匀浆后再加入平衡盐溶液进行离心，取上清再次离心，上清液经微孔滤膜过滤后即为制备好的对虾肌肉提取液。3.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述对虾血细胞培养基组成为:基础培养基为2 X Leibovitz’s L_15，其中添加质量分数为20%的胎牛血清和20%的所述对虾肌肉提取液，以及青霉素钠、硫酸链霉素钠和两性霉素B。4.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述分离对虾血细胞并进行原代培养的具体操作为:首先以海水洗净对虾体表，之后用含有青霉素和链霉素双抗的经过高温消毒的无菌海水暂养l-2d;对对虾体表进行消毒，然后利用吸入抗凝剂的无菌注射器按照抗凝剂:血淋巴体积比为1:1的比例于对虾头胸甲后缘处心脏取血，得到取抗凝血样品后进行离心，弃上清得到对虾血细胞，用上述制得的培养基调节血细胞密度并进行接种。5.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述中草药选取为黄芪、杜仲、黄连和大黄。6.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述中草药活性成分提取操作为:将中草药均匀粉碎后，与无水乙醇按照质量体积比为1: 10的比例混匀，70°C回流萃取1.5h，重复萃取两次，合并滤液，旋转蒸发除去乙醇即得中草药活性成分。7.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述的免疫相关指标为血细胞存活率、血细胞吞噬活性、抗菌活性及溶菌活性。8.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述中草药活性成分添加到对虾血细胞培养基中的添加量为每毫升培养基中添加黄芪多糖5-30mg、绿原酸3-30mg、小檗碱5-.30mg、大黄蒽醌提取物5-30mg。9.如权利要求2所述的快速筛选方法，其特征在于，所述平衡盐组成为:NaCl18.0 g.L-1,KCl 0.7 g.L-1,NaHCO30.5 g.L-1,KH2PO40.54 g.L-1.10.如权利要求4所述的快速筛选方法，其特征在于，所述的抗凝剂组成为:NaCl.26.325g.L-1,KCl 0.745g.L—\EDTA_2Na 3.7224g.L-1,HEPES 2.383.L-1.
【专利摘要】本发明涉及一种对虾用复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法，包括：1）对虾肌肉提取液的制备；2）血细胞培养基的配制；3）对虾血细胞原代培养；4）中草药有效成分的萃取；5）存活率、吞噬活性、抗菌及溶菌活性的测定。本发明在对虾血细胞原代培养体系中添加多种中草药提取物的组合，能够快速筛选出增强免疫效果较好的组合。本方法具有快速，高效，准确，稳定等优点，并且采用细胞培养，相较于传统的养殖模式，检测成本更低。
【IPC分类】C12Q1/02
【公开号】CN105648024
【申请号】
【发明人】潘鲁青, 高国瑞, 黄辉
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月29日