一种对虾用复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法，具体涉及一种利用对虾血细胞原代培养进行中草药免疫增强剂组合的快速筛选方法，属于水产养殖和生物筛选技术领域。
【背景技术】
[0002]近年来由于种质资源退化和养殖环境恶化，对虾病害爆发频繁，严重制约着对虾养殖业的发展。预防和治理病害的传统方法是使用抗生素，然而抗生素的广泛使用会导致药物残留、菌株耐药性的产生以及环境污染等问题，最终危及人类自身的健康。因此许多学者研究抗生素的替代物。中草药作为绿色天然药物，具有毒副作用小、多功效、不易诱发病原菌耐药性、低污染、价格低廉、资源丰富等优势，在水产无公害养殖病害防治中具有广阔的应用前景。
[0003]目前有关中草药免疫增强剂在生产上往往多种中草药配伍使用。而复合中草药的使用存在添加量大、有效成分含量使用不明、作用机理不清的问题。此外，复合中草药的筛选传统方法是采用养殖实验，实验周期长，易受外界因素影响，无法在短时间内筛选出合适的复方中草药免疫增强剂。并且传统重复筛选方法耗费大量的时间、人力、物力以及财力。
【发明内容】
[0004]鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种对虾用复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法。该方法能够快速和高效的筛选不同组合的中草药免疫增强剂，以克服现有技术的不足。
[0005]为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案如下:
一种对虾用复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法，其特征在于，该方法包括首先制备对虾肌肉提取液和血细胞培养基，然后分离对虾血细胞并进行原代培养，同时提取中草药活性成分，再将中草药活性成分添加到对虾血细胞培养基中对血细胞进一步培养，最后测定免疫相关指标。
[0006]所述对虾肌肉提取液的制备方法为:幼虾经暂养后，取腹部肌肉加入平衡盐进行匀浆，匀浆后再加入平衡盐溶液进行离心，取上清再次离心，上清液经微孔滤膜过滤后即为制备好的对虾肌肉提取液。
[0007]所述对虾血细胞培养基组成为:基础培养基为2XLeibovitz’s L_15，添加质量分数为20%的胎牛血清和20%的所述对虾肌肉提取液，以及添加青霉素钠使其在培养基体系终浓度为100IU.mL—1、添加硫酸链霉素钠使其在培养基体系终浓度为10yg.mL—1和添加两性霉素B使其在培养基体系终浓度为10yg.mL—1。
[0008]所述提取对虾血细胞并进行原代培养的具体操作为:首先以海水洗净对虾体表，之后用含有青霉素和链霉素且经过高温消毒的无菌海水暂养l-2d;对对虾体表进行消毒，然后利用吸入抗凝剂的无菌注射器按照抗凝剂:血淋巴体积比为I: I于对虾头胸甲后缘处心脏取血，得到抗凝血样品后进行离心，弃上清得到对虾血细胞，用上述制得的培养基调节血细胞密度并进行接种。
[0009]所述中草药选取为黄芪、杜仲、黄连和大黄。
[0010]所述中草药活性成分提取操作为:将中草药均匀粉碎后，与无水乙醇按照质量体积比为1:10的比例混匀，70°C回流萃取1.5h，重复萃取两次，合并滤液，旋转蒸发除去乙醇即得中草药活性成分。
[0011 ]所述的免疫相关指标为血细胞存活率、血细胞吞噬活性、抗菌活性及溶菌活性。
[0012]所述中草药活性成分添加到对虾血细胞培养基中的添加量为:每毫升培养基中添加黄苗多糖5_30mg、绿原酸3-30mg、小檗碱5-30mg、大黄蒽醌提取物5-30mg。
[0013]所述平衡盐组成为:NaCl18.0 g.L—1JCl 0.7 g.L—1、NaHC03 0.5 g.L—\KH2PO4 0.54 g.L—1，调节pH为7.2。
[0014]所述的抗凝剂组成为:NaCl26.325g.L-1、KCl 0.745g.L—1、EDTA_2Na3.7224g.L—\HEPES 2.383，调节pH为 7.0，渗透压为750m0sm kg—1。
[0015]本发明的优点和有益效果:本发明利用对虾血细胞原代培养，在培养基中添加多种组合的中草药提取物，培养24h即可以通过测定免疫相关指标，快速筛选出增强免疫效果较好的组合。本方法具有快速，高效，准确，稳定等优点，并且采用血细胞原代培养，相较于传统的养殖模式，检测成本更低。本发明能够快速、精确的筛选出具有免疫增强作用较好的中草药组合。
【附图说明】
[0016]图1实施例中对照组和试验组关于血细胞存活率的结果图。
[0017]图2实施例中对照组和试验组关于血细胞吞噬活性的结果图。
[0018]图3实施例中对照组和试验组关于抗菌活性的结果图。
[0019]图4实施例中对照组和试验组关于溶菌活性的结果图。
【具体实施方式】
[0020]以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。但是本发明的保护范围并不限于该实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
[0021 ] 实施例:
本实施例选用凡纳滨对虾作为试验对象，凡纳滨对虾是目前国内对虾养殖的主要品种。并选取了黄芪、黄连、杜仲和大黄四种中草药进行组合，作为快速筛选的免疫增强剂。
[0022]实验所用凡纳滨对虾购自青岛市崂山对虾养殖场，虾生物体长为8.0± 0.5cm，体色正常，健康活泼。暂养于40cmX50 cmX60 cm水槽中7天，海水盐度为32，温度为19±0.5°C，pH为8.1，连续充气，日换水两次，每次换水量为1/3-1/2，并投喂对虾配合饲料。
[0023]—种对虾用中草药免疫增强剂的快速筛选方法，包括以下步骤:
(I)制备对虾肌肉提取液
幼虾经暂养后，取腹部肌肉5g，加入5mL平衡盐，1500r匀浆2min。再加入15mL平衡盐溶液，1000g离心30min。取上清，16000g离心30min，上清液经0.22μηι微孔滤膜过滤，-20°c保存。
[0024](2)制备血细胞培养基
基础培养基为2 X Leibovitz’s L_15，添加质量分数为20%的胎牛血清和20%的凡纳滨对虾肌肉提取液，以及添加青霉素钠使其在培养基体系终浓度为100IU.mL—1、添加硫酸链霉素钠使其在培养基体系终浓度为10yg.mL—1和添加两性霉素B使其在培养基体系终浓度为10yg.mL—S并用质量分数为2.5%的HCl和7.5%的NaHCO3调节pH到7.0。
[0025](3)凡纳滨对虾血细胞分离及其原代培养
选取活力好的凡纳滨对虾，以洁净海水洗净对虾体表，用含有1000 yg.mL—1青霉素、1000 yg.mL—1链霉素且经过高温消毒的无菌海水暂养l-2d。取20尾凡纳滨对虾，实验前先用75%的酒精棉球消毒对虾体表，然后在超净工作台内用预先吸入已消毒的预冷抗凝剂的无菌注射器，按抗凝剂:血淋巴为1:1的体积比于头胸甲后缘处心脏取血，混合于离心管中，取抗凝血样品，4°C、300g离心1min，弃上清，用培养基调节血细胞密度106cel 1/mL，并接种于5mL圆底离心管，每管200yL。
[0026](4)中草药活性成分的提取
将黄芪、黄连、杜仲和大黄四种中草药分别均匀粉碎后，与无水乙醇按照I: 10的质量体积比例混匀，70°C回流萃取1.5h，重复萃取两次，合并滤液，旋转蒸发除去乙醇制备成有效成分提取物。采用该方法黄芪制得的主要提取物为黄芪多糖，杜仲为绿原酸，黄连为小檗碱，大黄为大