5111；[11后于570111]1处测定吸 光值A，得到的回归方程为y = 0.03382x+0.11274，R2 = 0.992，甘氨酸的分子量为75.07Da， 所以换算成-NH2基的μπιο?数的A-C关系为:C = 0.3939A-0.0444。测定样品中-NH2基时，先将 水解蛋白液稀释100倍，取〇. 40mL稀释液于试管中并加1.60mL超纯水、1. OmL显色剂，以后操 作同标准曲线。水解度计算公式为：水解度（DH) = (酶解液中总氮量/氨基态氮含量）X 100%〇
[0031]多肽转化率的测定
[0032] 先制作标准曲线，用5 % TCA溶液配制不同浓度的G1 y-Gl y-Tyr-Ar g四肽标准溶液， 取4.8mL标准溶液，加入3.2mL双缩脲试剂，混勾后静置lOmin，2000r/min离心10min，取上清 液于540nm处测定吸光值，得到回归方程y = 0.3596x+0.0012，R2 = 0.998。测定样品中的多 肽含量时，先取2.5mL样品溶液，加入2.5mL 10 %的三氯乙酸溶液，混匀后静置lOmin， 4000r/min下离心15min，将上清液转移到50mL容量瓶中，并用5%TCA定容，摇匀，以后操作 同标准曲线。多肽转化率（％ )=(原料总蛋白含量/多肽含量）X 100%。
[0033] DPPH清除率测定
[0034]取蛋白酶解液浓缩，喷雾干燥得鱿鱼皮胶原蛋白肽粉末。配制5mg/mL胶原蛋白肽 溶液，测定其DPPH清除率。取2mL DPPH溶液与同体积样品液混合摇匀在黑暗处反应30min， 于517nm波长处测定其吸光值。抑制率计算公式如下：
[0035] DPPH清除率（％ ) = [ 1 -(Ai-Aj) /Αο ] X 100 %
[0036] 式中：Ai为DPPH与样品的混合液的吸光度:Aj为乙醇与样品的混合液的吸光度;Ao 为DPPH与水的混合液的吸光度。
[0037]胶原蛋白肽分子量分布测定
[0038] 通过Waters 600高效液相色谱仪测量胶原蛋白肽分子量分布，色谱柱是TSK gel 2000SWXL 300mmX 7.8nm。吸取2mL样品于容量瓶中，用流动相乙腈/水/三氟乙酸（45/55/ 〇. 1)定容，微孔过滤膜过滤后进样，柱温为30 °C，流速为0.5mL/min，在220nm下检测。
[0039] 时间与加酶量的影响
[0040] 先用碱性蛋白酶在酶解温度为47.5°C、pH为10.5的条件下进行酶解，在用1:2(质 量比）的木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶(复合蛋白酶)在pH 7.5、温度50°C的条件下二次酶解， 分别考察时间与加酶量的影响。结果如表1所示：由极差分析结果可以看出，以水解度为指 标的因素影响程度依次为:C、D、A、B，即复合蛋白酶酶解时间>复合蛋白酶加酶量>碱性蛋 白酶酶解时间 >碱性蛋白酶加酶量，其最佳组合为:A2B2C3D3;以酶解液抗氧化活性为指标 的因素影响程度依次为:D、C、B、A，即复合蛋白酶加酶量>复合蛋白酶酶解时间>碱性蛋白 酶加酶量>碱性蛋白酶酶解时间，最佳组合为:AdsCsDs;以多肽转化率为指标的因素影响 程度依次为:A、B、C、D，即碱性蛋白酶酶解时间>碱性蛋白酶加酶量>复合蛋白酶酶解时间 >复合蛋白酶加酶量，最佳组合为:AXB2C2D2。
[0041] 表1
[0042]
[0043] 注:时间a:第一步酶解时间(碱性蛋白酶酶解时间）；时间b:第二步酶解时间（复合 蛋白酶酶解时间）。
[0044] 从结果可以看出，碱性蛋白酶第一步水解的时间对最终的酶解液多肽转化率影响 很大，因此第一步水解时间选择4h;碱性蛋白酶加酶量对酶解液多肽转化率也是排在第二 位的，因此选择0.3%;木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶的第二步水解时间对水解度的影响是排 在第一位的，所以选择4.5h;木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶的加酶量对酶解液抗氧化活性的 影响是排第一位的，所以加酶量选择0.4%。经过综合分析可知，本试验的较优条件为 八 182(：303，即先用0.3%碱性蛋白酶在?!110.5、温度47.5°(：条件下水解411，再用总量为0.4% 的木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶按1:2(质量比）在pH 7.5、温度50°C的条件下继续水解4.5h。 通过对工艺进行验证试验可知鱿鱼皮在该条件下酶解，其水解度可达28.89 %、DPPH清除率 为88.24%，多肽转化率为49.74%。
[0045] 在上述优化后工艺条件下制备获得的胶原蛋白肽分子量分布情况如表2所示：
[0046] 表 2
[0047]
[0048] 由表2可以发现经过碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的两步水解后制备获 得的胶原蛋白肽分子量较低，97.63%胶原蛋白肽分子量小于2000Da，84.56%胶原蛋白肽 分子量分布介于180Da~2000Da之间，其中，87.25%胶原蛋白肽分子量小于10000 &。表明碱 性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶3种酶复合酶解有利于小分子肽的形成。十个氨基酸组 成的小肽是比较好的产品，分子量小于1500Da，而分子量越小，越容易被有效吸收。所以，通 过此工艺提取的胶原蛋白肽品质较好，符合市场需求。另外，产品中分子量小于180Da的部 分比例较高，这可能与风味蛋白酶的酶解机制有关。风味蛋白酶为一种端肽酶，易将蛋白水 解成氨基酸，但它对产品风味的改善有很大的帮助。
【主权项】
1. 一种酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，其特征在于:原料鱿鱼皮预处理后，先 经碱性蛋白酶水解后，再经复合蛋白酶继续水解得到胶原蛋白水解液，其中，复合蛋白酶由 木瓜蛋白酶与风味蛋白酶组成。2. 根据权利要求1所述的酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，其特征在于:原料预 处理的步骤为:将鱿鱼皮解冻清洗干净，用0.5 %NaOH溶液浸泡12h，清水洗净之后，切碎，真 空包装后贮藏于_20°C冰箱。3. 根据权利要求1所述的酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，其特征在于:碱性蛋 白酶的加酶量为0.2~0.4%，碱性蛋白酶水解pH为9.5~10.5，碱性蛋白酶水解温度为47.5 ~52.5 °C，碱性蛋白酶水解时间为3~5h。4. 根据权利要求1所述的酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，其特征在于:复合蛋 白酶中，木瓜蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1:0.5~3。5. 根据权利要求1所述的酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，其特征在于:复合蛋 白酶的加酶量为0.2~0.4%，复合蛋白酶水解pH为7~8，复合蛋白酶水解温度为50~55°C， 复合蛋白酶水解时间为2~5h。6. 根据权利要求1所述的酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，其特征在于：先用 0.3%碱性蛋白酶在pH 10.5、温度47.5°C条件下水解4h，再用0.4%复合蛋白酶在pH 7.5、 温度50°C的条件下继续水解4.5h，复合蛋白酶中，木瓜蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1: 2〇7. 根据权利要求1所述的酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，其特征在于:水解后 得到的胶原蛋白水解液经活性炭过滤后，经过超滤、二级纳滤膜过滤后，再经过反渗透纳 滤，最后经过喷雾干燥得到分级的胶原蛋白肽粉。
【专利摘要】本发明涉及一种酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，原料鱿鱼皮预处理后，先经碱性蛋白酶水解后，再经复合蛋白酶继续水解得到胶原蛋白水解液，其中，复合蛋白酶由木瓜蛋白酶与风味蛋白酶组成。本发明工艺条件下制备得到的胶原蛋白肽产品，不仅水解度、DPPH清除率、多肽转化率等均较为理想，而且97.63％胶原蛋白肽分子量小于2000Da，具有较好的品质和较高的利用价值；本发明对鱿鱼皮胶原蛋白肽后期进一步的分离纯化及应用具有较高的理论指导意义。
【IPC分类】C12P21/06
【公开号】CN105648013
【申请号】
【发明人】刘振锋, 吕卫金, 黄小鸣, 戴圣佳, 刘东红, 陈士国, 叶兴乾
【申请人】浙江宇翔生物科技有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月14日