一种酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，尤其是涉及一种酶法制备鱿 鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法。
【背景技术】
[0002] 随着我国水产品加工业的迅猛发展，加工过程中产生大量的废弃物，包括鱼皮、鱼 鳞和鱼骨等，约占鱼体总重的50~70 %。但是水产品原料利用率低，大量水产品边角料和废 弃料被加工成饲料，没有进行精深加工，造成资源的极大浪费，更严重的是导致环境污染。 同时，水产加工原料利用率低、高附加值产品稀少等成为了水产加工业面临的最为突出的 问题，严重限制了水产加工业产业链的延伸和可持续发展。
[0003] 水产品加工副产物胶原含量很高，且与陆生动物来源的胶原蛋白相比，水产胶原 蛋白具有更高的安全性。胶原蛋白肽在消化、吸收、营养等方面具有很多优势，且由于活性 中心的暴露而具有很多独特的生理活性，如抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、抗衰老、预防关节炎、 降血压、促进伤口愈合、促进皮肤胶原代谢、免疫调节等多种生理功能。当前，胶原蛋白肽已 经被广泛的用于食品、生物医药及美容化妆品、饲料添加剂以及其他领域。
[0004] 胶原蛋白肽的研究与开发已成为近年来的热点，如何快速高效的提取纯化胶原蛋 白肽成为关键。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，通过该工艺方法可以 得到较好品质的胶原蛋白肽产品。
[0006] -种酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，原料鱿鱼皮预处理后，先经碱性蛋 白酶水解后，再经复合蛋白酶继续水解得到胶原蛋白水解液，其中，复合蛋白酶由木瓜蛋白 酶与风味蛋白酶组成。
[0007] 作为优选，原料预处理的步骤为：将鱿鱼皮解冻清洗干净，用0.5 %NaOH溶液浸泡 12h，清水洗净之后，切碎，真空包装后贮藏于-20°c冰箱。
[0008] 作为优选，碱性蛋白酶的加酶量为0.2~0.4%，碱性蛋白酶水解pH为9.5~10.5， 碱性蛋白酶水解温度为47.5~52.5°C，碱性蛋白酶水解时间为3~δΙ^ρΗ、酶解时间、酶解温 度、蛋白酶加酶量对酶解液抗氧化活性、酶解液水解度、多肽转化率均会产生不同影响。
[0009] 作为优选，复合蛋白酶中，木瓜蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1:0.5~3。木瓜蛋 白酶与风味蛋白酶的质量比不同，其酶解液抗氧化活性、水解度、多肽转化率均会有所不 同。
[0010] 作为优选，复合蛋白酶的加酶量为0.2~0.4%，复合蛋白酶水解pH为7~8,复合蛋 白酶水解温度为50~55°C，复合蛋白酶水解时间为2~5h <φΗ、酶解时间、酶解温度、蛋白酶 加酶量对酶解液抗氧化活性、酶解液水解度、多肽转化率均会产生不同影响。
[0011] 作为优选，先用0.3%碱性蛋白酶在pH 10.5、温度47.5°C条件下水解4h，再用 ο. 4 %复合蛋白酶在pH 7.5、温度50 °C的条件下继续水解4.5h，复合蛋白酶中，木瓜蛋白酶 与风味蛋白酶的质量比为1:2。结果酶解液的水解度可达28.89%、DPPH清除率为88.24%， 多肽转化率为49.74%，同时84.56%的胶原蛋白肽分子量分布介于180Da~2000Da之间，可 以得到较好品质的胶原蛋白肽产品。
[0012]作为优选，水解后得到的胶原蛋白水解液经活性炭过滤后，经过超滤、二级纳滤膜 过滤后，再经过反渗透纳滤，最后经过喷雾干燥得到分级的胶原蛋白肽粉。胶原蛋白水解液 经活性炭过滤后，经过超滤，其主要除去活性炭、大分子、悬浮物等杂质，二级纳滤膜过滤， 其主要用于胶原蛋白肽的分子量分级，根据不同需要，可将绝大多数的胶原蛋白肽集中在 某一分子量区间，更易于人体的吸收;再经过反渗透纳滤，其用于产品的脱盐与浓缩，在常 温下，使得胶原蛋白肽成为低盐母液，并可同时浓缩胶原蛋白肽;最后经过喷雾干燥得到分 级的胶原蛋白肽粉。
[0013]本发明工艺条件下制备得到的胶原蛋白肽产品，不仅水解度、DPPH清除率、多肽转 化率等均较为理想，而且97.63 %胶原蛋白肽分子量小于2000Da，具有较好的品质和较高的 利用价值;本发明对鱿鱼皮胶原蛋白肽后期进一步的分离纯化及应用具有较高的的理论指 导意义。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明所要保护的范围并 不限于此。
[0016] 材料与试剂
[0017] 鱿鱼皮:购于舟山鱿鱼加工厂，清洗沥干后贮藏于-20 °C冰箱。
[0018] 碱性蛋白酶（2.4AU/g)、风味蛋白酶（500LAPU/g):诺维信公司；木瓜蛋白酶 (200000U/g):广西南宁庞博生物工程有限公司;Gly-Gly-Tyr-Arg:Sigma公司；二苯代苦味 酰基自由基(DPPH)、硫酸铜、浓硫酸、硫酸钾、茚三酮、果糖、甘氨酸、三氯乙酸、无水乙醇、氢 氧化钠、浓盐酸等均为分析纯。
[0019] 仪器与设备
[0020] HH2型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪:上海嘉鹏科技有 限公司；UV-2550紫外可见分光光度计：日本SMMADZU公司；FD1.0-60型冷冻干燥机:丹麦 Heto公司；台式冷冻高速离心机：美国Thermo Scientific公司；Milli_Q超纯水装置:美国 MILLIP0RE公司；Kjeltec 2300全自动凯氏定氮仪:瑞典F0SS公司;Waters 600高效液相色 谱仪，美国Waters公司；DELTA 320pH计：瑞士METTLER TOLEDO公司；J0YN-8000T喷雾干燥 机:上海乔跃实业有限公司。
[0021] 参照图1，一种酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，原料鱿鱼皮预处理后，先 经碱性蛋白酶水解后，再经复合蛋白酶继续水解得到胶原蛋白水解液，其中，复合蛋白酶由 木瓜蛋白酶与风味蛋白酶组成。
[0022] 具体步骤如下：
[0023] 原料预处理
[0024] 将鱿鱼皮解冻清洗干净，用0.5%Na0H溶液浸泡12h，去除鱿鱼皮上的杂蛋白。清水 洗净之后，切碎，真空包装后贮藏于_20°C冰箱，用于后期试验。
[0025] 酶解过程
[0026] 取20g鱿鱼皮置于锥形瓶中，按1:4(质量比）的比例加水，调节至合适pH，按适当的 比例添加蛋白酶，封住瓶口后置于水浴锅中磁力搅拌水解一定时间，取出置沸水中灭酶 lOmin，冷却摇匀后离心（4000r/min，lOmin)，得到胶原蛋白水解液，贮藏于4°C冰箱;其中， 添加蛋白酶的过程为:先经一定量(0.2~0.4% )的碱性蛋白酶在一定pH(9.5~10.5)及温 度条件(47.5~52.5°C )下水解一段时间（3~5h)后，再经一定量(0.2~0.4% )的复合蛋白 酶在一定pH(7~8)及温度条件(50~55°C)下继续水解一段时间（2~5h)得到胶原蛋白水解 液，其中，复合蛋白酶由木瓜蛋白酶与风味蛋白酶组成，木瓜蛋白酶与风味蛋白酶的质量比 为1:0.5~3。即风味蛋白酶与木瓜蛋白酶在碱性蛋白酶酶解液基础上进行。
[0027]胶原蛋白水解液经活性炭过滤后，经过超滤，其主要除去活性炭、大分子、悬浮物 等杂质，二级纳滤膜过滤，其主要用于胶原蛋白肽的分子量分级，根据不同需要，可将绝大 多数的胶原蛋白肽集中在某一分子量区间，更易于人体的吸收;再经过反渗透纳滤，其用于 产品的脱盐与浓缩，在常温下，使得胶原蛋白肽成为低盐母液，并可同时浓缩胶原蛋白肽； 最后经过喷雾干燥得到分级的胶原蛋白肽粉。
[0028]水解度的测定
[0029]总氮的测定:凯氏定氮法，参照GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质 的测定》；
[0030]游离氨基氮的测定:取O.lOOOg干燥过的甘氨酸定容至100mL，取此液分别稀释成2 μ g/mL~2 0 yg/mL的溶液用于标准曲线绘制。取2mL稀释液加入1. OmL讳三酮显色齐丨」，摇勾后 于沸水浴中加热15min，冷却后加入5mL 40%乙醇溶液混勾，静置1